一种小麦茎秆断裂强度分子标记QWQD4B.4‑13及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，可应用于小麦产量育种领域，具体提供了一种小麦茎秆断裂强度分子标记及其应用。

背景技术：
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小麦是我国第二大粮食作物，全世界1/3以上的人口以小麦为主食。倒伏是小麦生产中普遍存在的问题，倒伏后的小麦，不仅产量降低、收割不便，而且严重影响产品质量，造成子粒瘪瘦、容重降低、磨粉品质变差、小麦商品性和可制作性能下降，直接影响到优质麦的生产与加工。小麦倒伏一般发生在茎秆基部10％-30％，即茎秆基部第二节和第三节，小麦茎秆断裂强度是小麦自身抗倒性的综合指标，与茎粗和秆壁厚、节间密度、茎秆结构特征、茎秆化学成分关系密切。前人对小麦茎秆的形态学、解剖学和生理学的研究较多，但缺乏遗传基础研究。在基因水平解析小麦茎秆断裂强度的遗传机理，对利用分子标记辅助选择和分子设计育种具有重要的意义。

新兴的分子标记辅助选择不受环境影响，可以进行程序化早代选择和预测，可显著提高目标性状选择的准确性，对加快小麦产量改良及保障我国粮食安全具有重要的现实意义和理论价值。目前，与小麦茎秆断裂强度有关的基因鉴定很少，缺乏分子标记辅助选择的有效标记，主要原因是受到以下两个方面的限制，一方面：目前多数发表的茎秆断裂强度QTLs位点没有经过育种过程或品种有效性验证；另一方面，由于单一遗传群体定位的基因位点，准确度差，而且由于置信区间大，QTLs过多或存在假阳性QTLs，降低了茎秆断裂强度分子辅助选择的实际效率，甚至无法有效应用到小麦育种中。

因此亟需提供一种针对于小麦茎秆断裂强度的实用性分子标记以利于小麦品质育种。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种小麦茎秆断裂强度分子标记，该标记位于小麦4B染色体TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之间，命名为QWQD4B.4-13；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增大茎秆断裂强度的QWQD4B.4-13基因位点，以加快抗倒伏小麦品种的选育进程，由于采用了专用的茎秆断裂强度分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了优质小麦品种或品系的选择效率和质量，提高了QTL检测的效应和定位精度，开发了实效性分子标记，研制茎秆断裂强度分子辅助育种体系，可以程序化应用于育种实践。

本发明采用以下技术方案：

一种小麦茎秆断裂强度分子标记QWQD4B.4-13，该标记位于小麦4B染色体TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。

发明人发现当小麦中含有该分子标记时，小麦的茎秆断裂强度增大。

在上述技术的基础上，通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否含有增大茎秆断裂强度基因位点QWQD4B.4-13，具体步骤为：

利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得721bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，之后利用AluI专一酶酶切后检测相应片段，如果利用AluI专一酶酶切后依然为721bp的片段，则证明该片段未被切断，该品种(系)含有茎秆断裂强度增效基因位点QWQD4B.4-13，如果检测后为含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2和3所述的两个片段，则证明该片段已被切断，该品种(系)不含有茎秆断裂强度增效基因位点QWQD4B.4-13。

为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其

正向引物序列：5′-GGT GGT TCC TTT CGA TTT TGC GC-3′(如SEQ ID NO:4所示)；

反向引物序列：5′-ACT AGT GAG TTT GTG TAC CGT AAC A-3′(如SEQ ID NO:5所示)；

通过特异性引物的扩增，以及对产物的酶切结果进行判定，通过这种方法可以判定该位点是否含有茎秆断裂强度增效基因位点，虽然小麦茎秆断裂强度受多个基因位点控制，但是由于本发明所判定的位点为主效基因位点，其对于小麦的茎秆断裂强度有着十分重要的增效效果，故而即可获知待测小麦植株中是否具有茎秆断裂强度增效效果的相关基因；为茎秆断裂强度基因聚合、进而改良小麦品质提供分子基础，从而可以更好的应用于品种选育和遗传改良中去。

综上所述，本发明的发明人首次提供了一种小麦茎秆断裂强度分子标记，该标记位于小麦4B染色体TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增大茎秆断裂强度基因位点的QWQD4B.4-13，以加快高产小麦品种的选育进程。由于采用了专用的茎秆断裂强度分子标记不仅筛选快速精准，选择目标明确，大大提高了抗倒伏小麦品种或品系的选择效率和质量。

附图说明

图1为利用本发明所述的分子标记和判定方法对高茎秆断裂强度和低茎秆断裂强度株系PCR扩增产物酶切验证结果电泳图；

图2为利用本发明所述的分子标记和判定方法对现有品种的茎秆断裂强度进行检测的结果示意图，图中品种1为山农01-35；2为山农20；3为62008；4为淄麦12；5:潍麦8；6为PH82-2；7为山农11；8:糯麦1号；9为济南17；10为济麦19。

具体实施方式

下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；

实施例1小麦的叶片DNA提取

(1)取0.3-0.5g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末；

(2)加入1600μL已预热至65℃的缓冲液S，多次倒置混匀，水浴0.5-1h，其间轻摇几次以充分混匀；

(3)降温到室温，等待10分钟，加10-15μL RNA酶(10mg/mL)37℃水浴30钟，其间轻摇几次以充分混匀，约1次/10min；

(4)取出离心管，加入等体积1600μL,4℃苯酚(Tris-平衡酚)：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)抽提，轻轻混匀10min，4℃冰箱静置5min，然后8000rpm离心10min；

(5)取上清液于另一管，约1300μL，加入等体积冷氯仿(4℃冰箱放置)，轻摇10min混匀，8000rpm离心10min；

(6)取上清液于另一管，加100μL 3M NaAC(醋酸钠)，加入1000μL的冷异丙醇(或2倍体积的冷乙醇)，充分混匀后于-20℃冰箱静置20min；

(7)用枪头挑出絮状的DNA，用70％乙醇清洗2-3次，离心5分钟，去掉乙醇，气干后(无乙醇气味即可)，溶于200μL 1×TE，轻轻混匀，-20℃储存；

(8)用微量可见/紫外分光光度计NanoDrop2000，测定DNA浓度，稀释DNA浓度为200ng/μL做为工作液。

其中所采用的溶液配制：

(1)3M NaAc(pH 5.2)

600mL H₂O中加408.24g NaAc-3H₂O，(或者246.24g无水醋酸钠)溶解后用冰醋酸(冰乙酸)调pH值至5.2，定容至1L，灭菌，备用。

(2)1×TE(pH 8.0)

800mL H₂O中加1.211g Tris、0.3723g Na₂EDTA-2H₂O，用HCL调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用。

(3)RNA酶：(若商业化配置好的1mL处理好的分装RNA酶，可以直接使用。)

将固体RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶浓度为10mg/mL，加热至100℃处理15 20min，慢慢冷却至室温，然后加入0.1倍体积1M Tris-HCL(pH7.4)，分装后于-20℃冰箱保存。

(4)缓冲液S

按照如下配方配制后，定容至1L：

其中10％SDS配制：

900ml水中100g溶解电泳级SDS，加热至68度助溶，加几滴浓HCL调节溶液PH到7.2，加水定容到1L，分装备用。

实施例2目标产物扩增

正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:4所示)

反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:5所示)

PCR扩增：其PCR扩增体系为20μL

备注：Mix可用：或(Taq酶0.25μL，DNK 2.0μL,Buffer1.5μL,MgCl0.4μL配置)

扩增条件：

通过上述扩增即可获得721bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例3 PCR产物专一性酶切：

酶切体系10μL：

专一酶AluI：0.3μL

PCR产物：2μL

10×NE buffer:1.0μL

ddH₂O:6μL

酶切反应条件：PCR扩增产物中添加0.3μL AluI专一酶(市场购得)，37℃水浴4h.然后将酶切体系65℃灭活5min。

将上述扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小为721bp，之后利用AluI专一酶酶切后检测相应片段，如果利用AluI专一酶酶切后依然为721bp的片段，则证明该片段未被切断，该品种(系)含有茎秆断裂强度增效基因位点QWQD4B.4-13，如果检测后为含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2和3所述的两个片段，则证明该片段已被切断，该品种(系)不含有茎秆断裂强度增效基因位点QWQD4B.4-13。

实验例

对已知小麦品种山农01-35，山农20，62008，淄麦12，潍麦8，PH82-2，山农11，糯麦1号，济南17和济麦19利用上述方法进行检测，结果如图2所示；

同时经过实际测量，含增效基因位点的品种(系)茎杆断裂强度平均值为15.14N，不含增效基因位点的品种(系)茎杆断裂强度平均值为6.74N。并且，两者之间的茎秆断裂强度值差异达到极显著水平(P<0.01)：

两种单倍型QWQD4B.4-13-T/C茎杆强度平均值及显著性差异

可见实测值与图2中的检测结果对应，本发明所提供的茎秆断裂强度分子标记不仅筛选快速精准，选择目标明确，大大提高了抗倒伏小麦品种或品系的选择效率和质量。