甘蓝型油菜核转录因子NF‑YA基因BnNF‑YA9及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9及其应用。

背景技术：

干旱、高盐等非生物逆境是影响植物生长和农作物产量的主要逆境因素。所以人们长期以来一直在寻找有效措施来培育能够抵抗非生物胁迫和在各种逆境下生长的农作物。随着分子生物学的发展，利用基因工程改良农作物抗逆基因，培育具有抗逆能力的新品种成为一种可行性方案。

每一个生物个体体内的基因表达都是受到时空限制和外界刺激引发的并被严格调节和控制的。转录因子(Transcription Factor)又称为反式作用因子，是指那些具有同真核生物基因启动子中的顺式作用元件特异性结合活性的蛋白质，它是由转录因子基因编码的。真核生物体内调控基因表达的是被称为转录因子的一类蛋白质，它可以激活下游相关基因的转录。利用激活抗逆基因的转录因子改良和增强植物的综合抗逆性成为一种很有潜力的方法。

最初在植物中报道NF-Ys基因可以追溯到上世纪九十年代。NF-Y(Nuclear factor Y)是一类转录因子，属于CCAAT框结合因子家族即CBF(CCAAT box binding factor)并存在于高等的真核生物中，它也被称为HAP(Heme-associated proteins)：它由三个亚单位组成，分别是NF-YA(动植物)/CBF-B(丝状真菌)/HAP2(酵母)、NF-YB/CBF-A/HAP3及NF-YC/CBF-C/HAP5。这三个亚单位能形成三聚合的复合体，该复合体能与下游基因启动子区域顺式作用元件CCAAT框结合，从而调控其表达。在真菌和动物中，每个亚基一般均是由一个单独的基因编码；然而，在植物中，不管是单子叶植物还是双子叶植物，均是多个序列相近的基因编码一个亚基的，从而形成一个基因家族。

NF-YA(CBF-B或HAP2)是转录调控因子NF-Y的一个亚基，它与另外两个亚基NF-YB、NF-YC组成异源三聚体，共同结合于下游基因的CCAAT框上，从而激活或抑制基因的表达。CCAAT-box一般位于启动子转录起始位点(TSS)上游-60～-100bp处，是启动子中的基本调控元件之一。NF-Y是非常保守的一类转录调控因子，每个亚基都有其特定的保守区域。NF-YA的保守区域位于C端，该区域负责与DNA序列结合，引导NF-YB/NF-YC异源二聚体结合于CCAAT-box。关于NF-Y异源三聚体的组装，一种可能的组装过程如图1-2所示：首先NF-YB与NF-YC结合形成异源二聚体，接着NF-YA再同异源二聚体结合形成完整的NF-Y，最后转录调控因子NF-Y与下游基因的CCAAT框结合。研究发现在拟南芥中，NF-YA与CO的蛋白结构相似。CO同样可以与NF-YB、NF-YC结合形成一个三聚体，该三聚体结合于FT基因的启动子中的CCAAT框上，并激活FT基因的表达。当对NF-YA过表达时，植物会表现出FT基因被抑制的现象。这说明在植物体内NF-YA与CO是相互竞争的关系，大量表达的NF-YA会竞争性地与NF-YB/NF-YC异源二聚体结合，从而造成CO的脱靶，进而抑制了FT基因的表达。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种甘蓝型油菜基因核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9，其CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9以甘蓝型油菜“南盐油1号”cDNA为模板，以BnNF-YA9-F和BnNF-YA9-R为引物，通过PCR扩增得到。

BnNF-YA9-F：5'GAAGATCTATGCAAGTGCCAACA 3'

BnNF-YA9-R：5'GGACTAGTCGTCCCTGACATGCT 3'

上述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

一种含有本发明所述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9重组载体。

所述的重组载体，是将甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9插入表达载体pCAMBIA1302的BglⅡ与SpeⅠ酶切位点之间所得。

一种含有所述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因的根癌农杆菌EHA105。

所述的根癌农杆菌，优选将上述的重组载体经电转化转入根癌农杆菌EHA105中。

上述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9在提高植物耐盐、耐干旱和/或抗外源ABA中的应用。

上述的应用，优选将含有甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9 CDS重组载体的根癌农杆菌EHA105，转入拟南芥中，多代繁殖后筛选获得纯合体。

本发明所述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA9在提高植物耐盐、耐干旱和/或抗外源ABA中的应用。

一种构建耐盐拟南芥的方法，将所述的根癌农杆菌EHA105转入野生型拟南芥经多代繁殖后筛选得到的纯合体即为耐盐拟南芥。

一种构建耐干旱拟南芥的方法，将所述的根癌农杆菌EHA105转入野生型拟南芥经多代繁殖后筛选得到的纯合体即为耐干旱拟南芥。

一种构建耐外源ABA拟南芥的方法，将所述的根癌农杆菌EHA105转入野生型拟南芥经多代繁殖后筛选得到的纯合体即为耐外源ABA拟南芥。

有益效果：

本发明克隆得到一个新基因序列，命名为BnNF-YA9，该基因的CDS全长为699bp，编码232个氨基酸。通过对该基因的初步序列分析表明，BnNF-YA9是一个NF-YA基因，具有两个不同功能的螺旋结构域A1和A2。其中A1可与NF-YB/C亚基相互作用，A2的特异序列CCAAT框和DNA相互作用。

构建BnNF-YA9的过表达载体，利用农杆菌EHA105介导，采用蘸花法侵染野生型拟南芥(Col-0)。经过多代的筛选成功获得BnNF-YA9转基因纯合体。

对BnNF-YA9的转基因纯合体拟南芥进行各项生理实验，结果显示：BnNF-YA9的过表达植株对盐、干旱和ABA处理表现出抗性。说明BnNF-YA9参与植物的非生物胁迫调控过程。

附图说明

图1、甘蓝型油菜基因BnNF-YA9序列的扩增结果；

图2、PCR验证转基因植株在转录水平上的表达。

图3、逆境处理下转基因拟南芥株系和野生型拟南芥的萌发率。

图4、逆境处理下转基因拟南芥株系和野生型拟南芥的总根长。

图5、逆境处理下转基因拟南芥株系和野生型拟南芥的总根尖数。

图6、逆境处理下转基因拟南芥株系和野生型拟南芥的根的伸长率。

具体实施方式

1.实施NF-YA基因BnNF-YA9的克隆

设计引物序列如下：

BnNF-YA9-F1：5'ACAATGCAAGTGCCAACA 3'

BnNF-YA9-R1：5'CTGGAGCAAGATTATGAC 3'

以甘蓝型油菜‘南盐油1号’的DNA为模板，用所设计的油菜BnNF-YA9的引物进行扩增，其PCR体系与反应程序如下：

PCR产物点入1％的琼脂糖凝胶中电泳，得到约722bp左右的特异条带，如图1所示。对目的片段进行切胶回收，连接克隆载体pMD19-T，将阳性菌株送交金维智公司测序，其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。，通过在线DNA折叠预测分析，确定新成员BnNF-YA9具有NF-YA基因家族的典型结构。

实施例2 NF-YA基因BnNF-YA9过表达载体的构建

由于BnNF-YA9是编码基因，所以将其插入过表达载体pCAMBIA1302中的35S和GFP基因中并将其与GFP连在一起形成一个融合蛋白，需要将BnNF-YA9的终止密码子去掉。根据载体上已有的酶切位点和BnNF-YA9的序列上的酶切位点，我们选择BglⅡ与SpeⅠ限制性内切酶，设计的引物如下，酶切位点如下划线所示：

BnNF-YA9-F2：5'GAAGATCTATGCAAGTGCCAACA3'

BnNF-YA9-R2：5'GGACTAGTCGTCCCTGACATGCT 3'

以SEQ ID NO.2的序列为模板，用高保真酶进行PCR扩增，反应体系如下：

PCR产物点入1％的琼脂糖凝胶中电泳，得到长度约为715bp左右的单一条带，与预期的大小相同。将该基因片段克隆至pEASY-Blunt平末端载体上(具体操作参照pEASY-Blunt Cloning Kit说明书进行)，即得到克隆载体pEASY-B-BnNF-YA9。

pEASY-B-BnNF-YA9和空载pCAMBIA1302分别用BglⅡ与SpeⅠ限制性内切酶酶切，然后将酶切后的pCAMBIA1302单一片段和克隆载体中的BnNF-YA9片段回收，然后用T4连接酶将二者酶连，即得到表达载体pCAMBIA1302-BnNF-YA9，表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α(TAKARA D9057S)中，挑选阳性克隆，送交公司测序。测序结果正确即表明载体构建成功。

实施例3.BnNF-YA9拟南芥转基因

1、蘸花法(农杆菌介导)转化拟南芥

蘸花法转化拟南芥的操作步骤如下：

农杆菌侵染重悬液的配制：蔗糖(50mg·L^-1)，silwet L-77(0.02％,V/V)，农杆菌菌体，无菌水；将保藏的含目的基因表达载体的农杆菌划线活化(有抗生素的固体YEP培养基)，挑取单克隆接种于50mL加抗生素的YEP液体培养基(Kan(50mg·L^-1)和Str(50mg·L^-1))，28℃恒温摇床，200rpm，培养2d，至OD600＝0.8～1.5；收集菌体：取上述菌液10mL分装与2mL的离心管中，4000～6000rpm离心3～4min，弃上层的培养基，用等体积的重悬液重悬菌体；用一次性胶头滴管吸取侵染菌液，小心滴入拟南芥的花蕾上，确保整个花絮都被浸润(第一次侵染时需将已经开花的花朵剪掉)；侵染后的拟南芥套上塑料袋，暗培养12～24h；去掉塑料袋后正常培养5～7d，再进行第二次侵染，同一植株可连续侵染2～3次，以增加转化的效率；转化2～3次的拟南芥恢复正常培养，及时剪除新长出的侧芽。在拟南芥生长后期可少量浇水，以加速拟南芥成熟；待少量角果开始变黄时，用信封将整株拟南芥包住，加速种子成熟；收取种子：去除杂质，将干净的种子装入1.5mL离心管中，存放于4℃冰箱中。

2、拟南芥转基因阳性苗的筛选。

实验准备：70％酒精溶液，无菌水，灭菌的枪头，含有抗生素的MS固体培养基(Hyg浓度为25mg·L^-1)；取适量待筛选的转基因拟南芥种子于10mL离心管中，加入去离子水浸泡至少30min；在无菌超净台中，70％的酒精浸泡拟南芥种子2min，倒去上层溶液后用无菌水冲洗5～6次；用无菌枪头吸取灭菌的种子涂布于MS平板上，再加入适量无菌水，轻轻摇晃平板使种子尽量铺展开来，小心吸取多余的无菌水；将铺有种子的平板开盖放置于超净台中，吹干培养基表面的水分，然后封好平板，4℃放置2d；冷处理后的种子放置于长日照(16-h light/8-h dark)，22～24℃环境中培养7～10d，挑选长势良好的拟南芥(阳性苗株型较大且根系较长)，移栽到基质中生长；待拟南芥有一定的生物量时，采集叶片提取RNA，并进行阳性苗验证。

3、拟南芥转基因阳性苗的鉴定

通过PCR扩增验证转基因阳性苗。

因为基因BnNF-YA9与表达载体pCAMBIA1302上的GFP基因融合在一起，所以转录产物将是BnNF-YA9-GFP，因此可设计引物如下引物是：Forward primer在BnNF-YA9区域里，Reverse Primer在GFP区域里。目的基因的验证引物如下：

35S-BnNF-YA9-F:5'ATGGCTTCTTGGCTCCT3'

GFP-R:5'TTCCGTATGTTGCATCACCT3'

为了更准确地验证转基因阳性苗，可以对PCR验证扩增的片段进行测序分析。PCR验证结果如图2所示。

4、拟南芥转基因纯合体的筛选

分别取40粒左右单株收取(F3代)的种子，按照步骤2中筛选转基因阳性苗的方法处理种子，并将种子放置于带有抗性的MS固体培养基上。冷处理后的种子放置于长日照(16-h light/8-h dark)，22～24℃环境中培养7～10d。所有幼苗都长势良好的株系即为纯合体株系，将确定为纯合体株系的幼苗移栽到基质中继续生长，等待收取下一代的种子。

已经筛选出2个35S::BnNF-YA2的纯合体株系的个数为4个。

实施例4.BnNF-YA9拟南芥转基因株系的发芽率测定

对转基因拟南芥和野生型(WT)植物种子进行消毒，用灭菌过牙签随机挑取每个转基因株系的50粒种子，分别点播到含有不同浓度NaCl(50mM、100mM和150mM)，甘露醇(150mM、200mM和250mM)、ABA(0.1μM、0.2μM和0.3μM)和空白对照CK的MS平板中，观察种子萌发对NaCl、干旱和ABA的敏感性。点播后种子在4℃冰箱中放置3d，平板正置，温室(22℃)正常培养。当种子幼根已经穿出种皮被认为萌发，每天统计种子的萌发率。BnNF-YA9的拟南芥转基因纯合体在空白对照CK、100mM NaCl、200mM甘露醇和0.2μM ABA处理下的萌发率如图3所示，结果显示转BnNF-YA9的拟南芥转基因株系在这三种处理下的萌发速率都不低于野生型，对逆境处理表现出抗性。

实施例5.BnNF-YA9拟南芥转基因株系的根伸长率测定

灭菌后的转基因和野生型种子，点播到MS平板中萌发。种子萌发后，用牙签小心将野生型和转基因株系各3棵萌发的幼苗分别转移到加NaCl、甘露醇、ABA的MS固体平板中，每个处理做3组生物重复。NaCl的浓度分别设定为50mM、100mM和150mM，甘露醇的浓度分别设定为150mM、200mM和250mM，ABA的浓度分别设定为0.1μM、0.2μM和0.3μM。每2天测量一次根生长的长度，总共计数5次，每次测量的时间点需保持一致(如10:00)。对多次测量结果取平均值，算出根的伸长率。根的伸长率统计结果如图6所示，从图中可以发现，在三种非生物胁迫处理下(NaCl、甘露醇、ABA)，BnNF-YA9的拟南芥转基因株系的根伸长率要高于野生型。

实施例6.BnNF-YA9拟南芥转基因株系的根系扫描

分别将实施例5中完成根的伸长率测定的转基因和野生型拟南芥植株移出，放入装有清水的透明方形塑料平板中。用牙签小心将每株拟南芥的根系分开，并放入根系扫描仪中进行根系扫描，最终获得并记录总根长(Length)、根尖数(Tips)等数据。统计分析结果如图4和图5所示，在NaCl、甘露醇和ABA处理下，过表达BnNF-YA9的拟南芥的总根长、根尖数都要比野生型的高。从而显示出过表达BnNF-YA9的拟南芥植株对非生物胁迫有抗性。