本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
由禽腺病毒I群4型引起的心包积液肝炎综合症(HHS)是侵害鸡的一种急性传染病，以高发病率和高死亡率、心包腔中有淡黄色积液，肝脏肿大质脆，多发性局灶性坏死，肾脏肿大为特征。该病于1987年3月在巴基斯坦发生，随后在墨西哥、印度、秘鲁等很多国家均有发生，我国对该病的相关报道较少。这一疾病自从被发现以来，给养禽业造成重大的经济损失。大多数报道心包积液肝炎综合症是一种主要危害肉鸡的疾病，主要侵害3～5周龄的肉鸡和未成年的种用后备肉鸡，但在最近几年中，其在商品蛋鸡的高死亡率方面也起着重要作用。早在2010年我国就有零星发生，但没有形成大的流行趋势，在2015年初夏时开始发病急剧上升，首先从山东地区开始，后各地陆续报导增多。现有技术中，还未有商品化的I群4型禽腺病毒灭活疫苗。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCC NO：V201645，该毒株在SPF鸡胚中增殖，病毒含量大于等于105.80EID50/0.2ml，且具有优良的免疫原性。
本发明的另一目的是提供I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的制备方法，该方法简单、安全、高效，抗原增殖滴度较高。
本发明的再一目的是提供一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，含有灭活的I群4型禽腺病毒SD2015株，该毒株在SPF鸡胚中增殖，病毒含量大于等于105.80EID50/0.2ml，上述I群4型禽腺病毒灭活疫苗免疫后抗体水平高、持续时间长，对肉鸡、蛋鸡及其子代保护率高，能较好地控制禽心包积液肝炎综合征疾病的发生与流行。
本发明还提供所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全，成本低。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
本发明提供一种I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCC NO：V201645。
本发明还提供一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，含有灭活的所述I群4型禽腺病毒SD2015株。
优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。
本发明还提供制备I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的方法，采用SPF鸡胚增殖所述I群4型禽腺病毒SD2015株，得到I群4型禽腺病毒SD2015株毒液。
优选的技术方案中，将所述I群4型禽腺病毒SD2015株接种SPF鸡胚，收获病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体，匀浆，冻融，离心取上清液，得到I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液。
本发明还提供一种所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，包括：
(1)采用甲醛灭活I群4型禽腺病毒SD2015株；
(2)将注射用白油和司本-80按照体积比94：6混合混匀，作为油相溶液；
(3)将灭活的I群4型禽腺病毒SD2015株毒液和吐温-80按照体积比96：4混合均匀，作为水相溶液；
(4)乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比2～3:1混和均匀、乳化，即获得所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗。
优选的技术方案中，灭活后的I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液中甲醛的体积百分浓度为0.15％～0.25％。
优选的技术方案中，0.2ml I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的病毒含量≥105.80EID50。
有益效果：本发明I群4型禽腺病毒SD2015株在鸡胚上培养，毒价高，达到105.80EID50/0.2ml以上，免疫原性好，对鸡和环境均安全。本发明I群4型禽腺病毒灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，能较好地控制禽心包积液肝炎综合征疾病的发生与流行，显著提高养禽生产的经济效益。
附图说明
图1是Hexon基因扩增产物的电泳图。
具体实施方式
实施例1 I群4型禽腺病毒SD2015株的筛选与鉴定
1.病毒的分离
取山东地区发病鸡群临床症状出现心包积液，肝脏肿大质脆或坏死，肾脏肿大的病鸡的肝脏组织，与灭菌PBS缓冲液以1∶2混合后研磨，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，反复冻融3次，8000r/min离心15分钟，8层纱布过滤后，取滤液用0.22μm滤器过滤后经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚15枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育10天，弃去接种后48h内死胚，取接种后48h～240h死亡鸡胚，死亡鸡胚表现为胚体出血、蜷曲、肝脏肿大质脆、出血或坏死，有的死胚出现心包积液。取死亡鸡胚的尿囊液、尿囊膜及胚体(去眼睛、喙及腿)，匀浆，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，置灭菌的容器中冻融3次，8000r/min离心15分钟，取上清液采用8层纱布过滤，取滤液-20℃保存，以备进行鉴定并作进一步纯化。
2.动物回归试验 将本实施例标题1最终得到的上清液接种10只28日龄SPF鸡，每只颈部皮下注射0.2ml，连续观察7天，记录结果。结果攻毒后3天10/10发病，至第5天10/10死亡，临床症状表现为精神萎顿，食欲下降，羽毛松乱、排黄绿色稀粪，严重者卧地不起直至死亡。剖检发现，死亡鸡心包充满淡黄色积液；肝脏肿大、质脆，有的边缘有坏死斑点；肾脏肿大。取死亡鸡肝脏制备组织切片观察病理组织学病变，肝细胞多灶性凝固性坏死，伴有单核细胞浸润和嗜碱性核内包涵体。取病变肝脏匀浆后进行电镜检查，可发现鸡肝细胞中有大量典型的六角形腺病毒粒子。
3.病毒的鉴定
3.1PCR检测及基因测序
提取上述分离的病毒液(即本实施例标题1最终得到的上清液)中的DNA，具体步骤如下：取病毒液400μl，加入12.5μl蛋白酶K溶液和50μl浓度为10％的SDS溶液，混匀，56℃作用30min；依次加入200μl氯仿和200μl苯酚，剧烈震荡15s，室温放置5min；4℃、12000rpm，离心10min；取上清，加入等体积的氯仿混匀，室温放置5min；4℃、12000rpm，离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积、浓度为3M的乙酸钠溶液，-20℃放置30min；4℃、12000rpm，离心10min；弃上清，加入75％的乙醇溶液1000μl洗涤；4℃、12000rpm，离心5min；弃上清，干燥10min；加入30μl双蒸水溶解沉淀并作为模板进行PCR扩增。
设计一对I群禽腺病毒Hexon基因区域引物进行PCR鉴定。
Hexon上游引物为5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’，
Hexon下游引物为5’-GGTTAATGAAGTTATCCCTGAACCC。
PCR扩增的反应体系(20μl)：模板3μl，2×Premix Taq(购自上海生工生物工程有限公司)10μl，Hexon上下游引物各1μl，双蒸水5μl。
PCR反应程序：94℃预变性5min；进入循环：94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结果(图1)显示分离毒株扩出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。将扩增出的目的片段送上海英骏生物技术有限公司进行测序，结果显示片段大小为686bp，序列如SEQ ID NO:1所示。
采用DNAStar软件对测得的Hexon基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)进行分析，并分别与GenBank中I群禽腺病毒毒株的相应序列进行比较，发现所分离的病毒与I群4型禽腺病毒同源性为99％～100％。因此，PCR检测结果证明分离的病毒是I群4型禽腺病毒。
3.2外源病毒的检验
对本实施例标题1最终得到的上清液进行外源病毒检测。首先是有血凝价病毒的检测，无菌采集SPF鸡和鸭抗凝血10ml，1500rpm离心10分钟，用灭菌PBS缓冲液洗3次，然后配成1％红细胞，4℃保存备用。按常规方法检测本实施例标题1最终得到的上清液是否具有凝集鸡和鸭红细胞的特性，同时设禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果阳性对照成立，而该分离病毒不能凝集1％鸡和鸭的红细胞。其次是传染性法氏囊病毒(IBDV)和禽传染性贫血病毒(CAV)的检测，参照相关文献合成用于检测CAV(引物CAVPl和CAVP2)和IBDV(引物IBDVPl和IBDVP2)的相关引物，其中CAV引物扩增片段的长度为675bp，IBDV引物扩增片段的长度为1300bp。
序列如下：
引物CAVPl：5’-GACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTC-3’；
引物CAVP2：5’-GGCTGAAGGATCCCTCATTC-3’。
引物IBDVPl：5’-AGCCTTCTGATGCCAACAAC-3’；
引物IBDVP2：5’-ATCTGTCAGTTCACTCAGGC-3’。
以本实施例标题1最终得到的上清液中DNA为模板均未扩增出传染性法氏囊病毒和禽传染性贫血病毒的目的片段。
以上结果说明分离的病毒中不含有具有血凝价的病毒及常与腺病毒混合感染的传染性法氏囊病毒和禽传染性贫血病毒。
3.3无菌检验
按照现行《中国兽药典》附录进行检验。取本实施例标题1最终得到的上清液接种TG小瓶，37℃培养3天，无菌生长。转种的TG小管、GP小管、GA斜面培养5天后均无菌生长。接种支原体液体培养基、再转接固体培养基，观察结束均阴性。
4.I群4型禽腺病毒有限稀释法纯化
将本实施例标题1最终得到的上清液按1∶10、1∶100、1∶1000倍稀释，每个稀释度分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育10天，记录鸡胚死亡情况。弃去48h内的死亡鸡胚，收获48～240h死亡鸡胚。选取接种最高稀释倍数病毒液后在48～240h死亡且出现典型的胚体出血、蜷曲，肝脏肿大、质脆、出血或坏死且尿囊膜增厚等病理变化(即HHS特征性病变)的鸡胚，取其尿囊液、尿囊膜及胚体(去眼睛、喙及腿)，匀浆，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，置灭菌的容器中冻融3次，8000r/min离心15分钟，取上清液采用8层纱布过滤，取滤液采用上述相同方法稀释、接种、检测鸡胚，直至同批病毒液不同稀释度接种鸡胚后发病率均达到100％，得到E1代种毒，命名为I群4型禽腺病毒SD2015株，并送中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC)，保藏单位地址为武汉大学，保藏日2016年8月24日，其微生物保藏编号为CCTCC NO：V201645。
5.种毒的传代
将I群4型禽腺病毒SD2015株E1代种毒病毒液进行1∶1000倍稀释后，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚15枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵育10天，弃去接种后48h内死胚，取接种后48～240h死亡且出现典型病变的鸡胚，典型病变为尿囊膜增厚，胚体出血、蜷曲，肝脏肿大、质脆、出血或坏死。取典型病变死亡鸡胚的尿囊液、尿囊膜及胚体(去眼睛、喙及腿)，匀浆，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，置灭菌的容器中冻融3次，8000r/min离心15分钟，取上清液采用8层纱布过滤，取滤液分装，-20保存备用，标记为E2代种毒。如此反复传到E15代。
6.I群4型禽腺病毒SD2015株种毒的毒力测定
6.1E1代种毒对鸡胚的毒力
将I群4型禽腺病毒SD2015株E1代种毒作1∶1000倍稀释，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚20枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃继续孵育10天。定时照蛋，弃去48h内的死亡鸡胚，及时取出死亡胚。观察接种后10天鸡胚的死亡率及死亡鸡胚的病变情况。结果见表1，鸡胚接种后5～8天全部死亡，死亡时间集中在6～7天，剖检发现死亡鸡胚均出现尿囊膜增厚，胚体出血、蜷曲，肝脏肿大、质脆、出血或坏死等典型的禽心包积液肝炎综合征的病变，接种后孵育10天，死亡率和病变率均达100％。
表1 E1代种毒对鸡胚的毒力测定结果
6.2种毒病毒含量测定
测定I群4型禽腺病毒SD2015株各代次种毒的病毒含量。用灭菌PBS缓冲液将种毒作10倍稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7这4个稀释度，每个稀释度经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵育10天，弃去接种后48h内死胚，记录接种后48～240h鸡胚死亡情况，死亡鸡胚或活胚表现为尿囊膜增厚，胚体出血、蜷曲，肝脏肿大质脆、出血或坏死，判为感染。根据鸡胚死亡及病变个数，按Reed-Muench法计算病毒含量。各代次种毒的病毒含量见表2。
表2 各代次种毒病毒含量测定结果
6.3E1代种毒对鸡的毒力
将E1代种毒作1∶1000倍稀释，分别颈部皮下注射1日龄、14日龄、28日龄、49日龄、70日龄、100日龄、150日龄SPF鸡，攻毒剂量为1000EID50/0.3ml/只，接种后观察7天统计发病率，判定感染标准为心包有淡黄色液体，肝脏肿大质脆、出血或坏死，肾脏肿大。结果表明：E1代种毒对1日龄、14日龄、28日龄、49日龄、70日龄、100日龄、150日龄SPF鸡有不同程度的感染性与致死性，1日龄SPF鸡对I群4型禽腺病毒SD2015株的感染性较强，颈部注射48h后，100％发病且发病急，发病鸡精神萎顿，卧地不起，排黄色稀粪，72h全部死亡。剖检出现典型的心包积液，肝脏肿大、出血；肾脏肿大。对28日龄的感染性试验，接种后72h内全部发病，所有发病鸡精神萎顿，食欲减少或废绝，打盹蜷缩、羽毛蓬松，排黄绿色粘液样粪便，严重者卧地不起，死亡时间集中在接种后48～96h，剖检死亡鸡，心包有不同程度的心包积液，肝脏肿大、坏死，肾脏肿大，部分死亡鸡肺脏水肿，腺胃乳头以及肌胃腺胃交界处出血。E1代种毒对100、150日龄SPF鸡的感染性试验发现所有接种后死亡鸡均出现不同程度的心包积液、肝脏肿大或坏死、肾脏肿大这些典型的病理变化，但是有的发病鸡只是一过性的临床发病，比如精神沉郁、食欲减少、公鸡鸡冠变淡、下垂等临床症状，而剖检时并不是每只发病鸡均出现心包积液、肝脏肿大或坏死以及肾脏肿大这三个典型的病理变化。另外鸡的日龄越大，相同剂量的病毒液对其致死性越低，结果见表3、表4。
表3 1、28、49、70、100、150日龄SPF鸡感染后7天内各组临床发病与死亡记录
表4 1、28、49、70、100、150日龄SPF鸡感染死亡鸡各脏器病变结果
7.免疫原性：采用常规方法以I群4型禽腺病毒SD2015株E3、E9、E15代种毒制备疫苗，将疫苗以颈部皮下注射21日龄SPF鸡各10只，每只0.3ml，设同日龄SPF鸡10只对照，免疫3周后，所有免疫鸡和对照鸡均用I群4型禽腺病毒SD2015株肝组织毒进行颈部皮下攻毒，攻毒剂量为0.3ml/只(约含10ID50)。攻毒后，观察7天判定结果。结果为对照组鸡全部发病且9/10死亡，免疫鸡保护率为90％～100％。结果表明：I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗的免疫效果很好，毒种在15代以内免疫原性稳定。结果见表5。
表5 I群4型禽腺病毒SD2015株各代次毒种免疫原性测定结果
实施例2 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗的制备
1.制苗用材料的选择 选择发育良好的6～7日龄SPF鸡胚作为制苗用材料。
2.制苗用病毒液的制备
2.1接种 取I群4型禽腺病毒SD2015株，用灭菌PBS缓冲液按照1:1000倍稀释，卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，不必翻蛋。
2.2孵育和观察 接种后48h内，每天照蛋一次，弃去死亡胚；接种48h以后，每8个小时照蛋一次，及时取出死亡胚，置2～8℃。
2.3收获 孵化至16日龄，将鸡胚全部取出，置2～8℃过夜。用强力碘消毒蛋壳气室部位，经75％酒精二次消毒后，以无菌方法去除蛋壳，分别收集具有HHS特征性病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体(去眼睛、喙及腿)。将绒毛尿囊膜和胚体用组织捣碎机匀浆，用收获的鸡胚尿囊液作为稀释液制成悬液，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时，冻融3次后，置灭菌容器中，8000转离心15分钟，取上清液用8层纱布过滤，滤液即为病毒液。
其中，HHS特征性病变鸡胚是指：接种48h以后的死亡鸡胚具有下列症状：尿囊膜增厚，胚体出血、蜷曲，肝脏肿大质脆、出血或坏死。
2.4病毒含量测定 取I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液，按实例1病毒含量测定方法进行测定，0.2ml病毒液中病毒含量≥105.80EID50。
2.5灭活 向检验合格(病毒含量≥106.0EID50/ml为合格)的病毒液中，加入体积百分浓度为10％的甲醛溶液，使灭活后的病毒液中甲醛终浓度为0.2％(体积百分浓度)，置37℃恒温摇床中摇振灭活36小时(以瓶内的温度到达37℃开始计时)，灭活后的病毒液置2～8℃保存。
3.半成品检验
3.1无菌检验 参照实例1的无菌检验进行。
3.2灭活检验 取6～7日龄SPF鸡胚10个，每胚卵黄囊接种灭活后的病毒液0.2ml，继续孵育10天，剖检，应无HHS病变。取上述鸡胚的尿囊液、尿囊膜及胚体，研磨，制成悬液，再接种6～7日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，孵育10天，剖检，应无HHS病变。
4.油佐剂灭活疫苗的制备
4.1油相制备 94体积份注射用白油、6体积份司本-80，加入油相罐中，加热搅拌混匀，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到油相。
4.2水相制备 取96体积份灭活的I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液，加入4体积份吐温-80，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，得到水相。
4.3乳化 将3体积份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入1体积份水相，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6～8次)，得到I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗。取10ml灭活疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。
该I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗，每羽份(0.3ml)的抗原含量应≥105.0EID50。实际生产过程中，根据病毒液实际病毒含量，可以采用pH7.2的PBS缓冲液(浓度0.1mol/L)对病毒液进行适当的稀释，只要保证最终的灭活疫苗中，每羽份(0.3ml)的抗原含量≥105.0EID50即可。
5.作用与用途 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗用于预防禽心包积液肝炎综合征。14日龄以上鸡均可免疫接种，接种后7～14日产生免疫力，免疫期为6个月。
6.用法与用量 每只鸡颈部皮下注射0.3ml。
实例3 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗免疫效力试验
按实施例2中方法制备I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗(批号：20151212、20160116、20160201)并按下列方法进行成品的效力检验。各批号灭活疫苗中I群4型禽腺病毒SD2015株的病毒含量均为105.0EID50/羽。I群4型禽腺病毒SD2015株肝组织毒：将感染I群4型禽腺病毒SD2015株的SPF病死鸡的病变肝脏，与灭菌PBS缓冲液以1：2混合后研磨，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，反复冻融3次，8000r/min离心15分钟，8层纱布过滤后取滤液，进行无菌检测(方法同实施例1中)和外源病毒检测(方法同实施例1中)，应均无其他病原的污染，-70℃保存备用。
1.血清学效力检验：每批苗取21日龄SPF鸡20只，每只颈部皮下注射0.3ml灭活疫苗；另20只作为对照组，不免疫。免疫后7天、14天、21天、1月、2月、3月、4月、5月、6月采血，分离血清，测定HHS中和抗体和琼扩抗体(参照现行《中国兽药典》方法)。结果见表6、7，三批次灭活疫苗均在免疫后7～14天产生HHS中和抗体和琼扩抗体，免疫后21天至6个月HHS中和抗体平均值均不低于1:5000(不低于1∶5000为合格)，琼扩抗体平均值均不低于1∶2.0(不低于1∶2.0为合格)。
表6 三批次I群4型禽腺病毒SD2015灭活疫苗免疫后HHS中和抗体平均值测定结果
表7 三批次灭活疫苗免疫后HHS琼扩抗体平均值测定结果
2.I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗免疫攻毒保护效力检验：取本实施标题1中免疫21天后的免疫组SPF鸡和对照SPF鸡各10只，用I群4型禽腺病毒SD2015株肝组织毒进行颈部皮下攻毒，攻毒剂量为0.3ml/只(约含10ID50)。攻毒后，观察7天判定结果。从表8中可以看到，对照组全部发病，9/10死亡，剖检死亡鸡及发病存活鸡均具有禽心包积液肝炎综合征的典型症状，心包积液，肝脏肿大、质脆、出血或坏死，肾脏肿大。免疫组保护率90％～100％。结果表明：I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗的免疫效果很好。
表8 三批次I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗攻毒保护效力试验结果
实施例4 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗对蛋鸡及其子代的免疫效力
检测采用实施例2中方法制备的I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗对蛋鸡及其子代的免疫效力，灭活疫苗批号为20151212，病毒含量见实施例3。
将批号为20151212的I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗(自制苗)免疫18周龄海兰蛋种鸡20只，另10只不免疫，作为对照组，按照自制苗剂量0.3ml/只接种，免疫后7天、14天、21天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血，分离血清，测定HHS中和抗体和琼扩抗体，评价疫苗免疫效果；在免疫后1～6个月，收集免疫鸡群种蛋(公母混群，平养本交)，孵化后进行子代攻毒保护试验，通过子代获得的母源抗体保护力评价疫苗的免疫持续期。中和抗体水平以均值不低于1∶5000，琼扩抗体以均值不低于1∶2.0判为合格。子代攻毒保护试验中，用I群4型禽腺病毒SD2015株肝组织毒进行颈部皮下攻毒，攻毒剂量为0.3ml/只(约含10ID50)，攻毒后，观察7天判定结果，以免疫组8/10以上保护，对照组8/10以上感染判为合格。结果表明：该批次疫苗免疫后6个月，鸡群血清中和抗体为1∶5024，琼扩抗体1:2.4，结果见表9。子代攻毒保护率为90％～100％，对照组全部感染，结果见表10。试验结果说明母鸡免疫后1～6个月产生的抗体可以对子代提供有效保护。
表9 20151212批SD2015株灭活疫苗免疫后HHS中和和琼扩抗体测定结果
表10 20151212批SD2015株灭活疫苗免疫蛋鸡对子代的攻毒保护测定结果
实施例5 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗双倍剂量接种安全试验
按实施例2中方法制备3批次I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗(批号：20151212、20160116、20160201)。
考察对象为14日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和14日龄白羽肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照；对白羽肉鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批I群4型禽腺病毒SD2015灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各组随机抽取试验鸡5～10只，剖检注射部位，检查疫苗的吸收情况。
结果：接种后14日内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表11。接种后14天，各组取5～10只鸡剖检注射部位，80％以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全；注射后28天剖检，70％以上疫苗已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表12。因此，I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。
表11 双倍剂量接种I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗后14天内临床观察结果
表12 I群4型禽腺病毒SD2015株灭活疫苗的吸收检验结果
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法
<130> 20160930
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 686
<212> DNA
<213> I群4型禽腺病毒SD2015株
<400> 1
agcggtattt cagcccccca gtttctgtgg tggttgaagg ggttgacgtt gtccatctgg 60
tcgatggacc aacgcgcacc cacgttcgtg aacatgtcga cgacgttggt gagggggacg 120
cgcttgttca tgtactcgta ggtggtaggc gcgacgctgg tggcgtcgaa gccggagatg 180
ctaaacttgt aacggtcggg cagatactcg gcgatgttgg ccatgataaa gttgcgcctc 240
tgggtagcgc tgatatcgat ttcgtaggag ggtaccgtgc cgaagtagaa gttggtagtg 300
gcgttagcca cggcggtgtt tttgtcgttc gcggcggtgt tgttggtgta gagtttaatt 360
tgactgagat cggggccgta gccttctccc gcgcctaccg cttcggggtt gaaggcgtag 420
ctgggcgcgc cttcttcgta accgtcattg gagaagactc gcacctcggg gtcgtactgg 480
tccacggcct ggttccacag ggcgaaatag tgatggcggg acatcatgtc ggccagcatg 540
tactggtagc tgagctcggt attccggtcg ggcagctcga ccaccacgtt catgcccgaa 600
cgctccgagt tgagggtgcc cgagcacacg ccggagtcgt gatacagcag gttaatgaag 660
ttatccctga acccgatgta gttggg 686