杂交瘤细胞株XA272‑919、抗体及其应用的制作方法

本发明涉及杂交瘤细胞株、抗体及其应用，具体涉及用于检测人CTRP9的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。
背景技术：
：C1qandtumornecrosisfactorrelatedprotein9(CTRP9)是主要由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，作用于肌肉和肝脏，调节全身葡萄糖和脂质代谢等。在肾脏、小肠、肺脏及成纤维细胞等器官、组织细胞中也有所表达。CTRP9由分泌信号肽、短N端可变区域、胶原区域及C端球状结构域构成，成熟蛋白不含其N端信号肽(19个氨基酸残基)。C端球状结构域与C1q结构类似，与脂联素高度相似，可以与其他蛋白或者受体相互作用，因此被认为是其功能结构域。CTRP9是具有诸多生理功能的新型脂肪因子，具有降低血糖、舒张血管及心肌保护等诸多生理作用。骨骼肌细胞中，CTRP9可以长期激活AMPK通路，增加线粒体的含量和上调脂肪酸氧化相关基因的表达，从而降低了脂肪组织的形成。在股动脉损伤模型中，CTRP9过量表达可以激活cAMP/PKA/ERK通路，抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，大幅度降低新生内膜的形成。人脐静脉内皮细胞和新分离血管环中，重组CTRP9蛋白可以通过AMPK/eNOS通路提高一氧化氮产量使血管扩张。同时，CTRP9具有显著的缺血心肌及血管保护作用，尤其是在心肌及血管组织表达分泌量是脂联素的100倍以上，而心肌缺血损伤时其心肌分泌及血浆含量均显著降低，具有很高的特异性，CTRPs是潜在的肥胖相关心脏病病情评估的生物标记物及干预靶点，有望在治疗代谢综合征和心力衰竭等方面发挥重要作用。目前用于人CTRP9定量检测的方法只有ELISA法，较为可靠的产品只有BioVendor的产品，但是也存在偏差较高、价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人CTRP9含量等缺点。技术实现要素：针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种用于产生抗人CTRP9单克隆抗体的杂交瘤细胞株XA272-919，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：C2016111，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏时间：2016年6月16日。本发明的杂交瘤细胞株产生的抗体的序列为：重链可变区：QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS；CDR1序列：TYNIH；CDR2序列：AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT；CDR3序列：GGNAMDY；轻链可变区：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK；CDR1序列：KSSRTLLYSSNQKNYLA；CDR2序列：WASTRES；CDR3序列：LQYYSYVT。本发明杂交瘤细胞株分泌产生的抗人CTRP9单克隆抗体。本发明抗体用于检测人CTRP9的应用。本发明抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。本发明还提供了人CTRP9检测试剂盒。所提供的人CTRP9检测试剂盒包括上述抗体。本发明的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：样品稀释液、底物稀释液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。附图说明图1为重组人CTRP9蛋白的电泳图，1、Marker；2、破碎上清；3、镍柱流穿液；4、500mM咪唑洗脱液；5、重组人CTRP9蛋白。具体实施方式以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些的任何限定。以下实施例中使用的辣根过氧化物酶(HRP)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基因序列优化、合成克隆由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；抗体测序由北京安必奇生物科技有限公司完成；Ni-NTA纯化柱购自GE公司；内毒素去除柱购自赛默飞世尔(中国)有限公司；DMEM高塘培养基、胎牛血清为Hycolon公司产品。实施例1:本发明杂交瘤细胞株的制备根据人CTRP9序列(GenBankACCESSIONNM_030945)开放阅读框序列，进行针对大肠杆菌偏好性进行密码子优化，人CTRP9全基因合成(序列为：ATGCAGGATACCTGCAGACAGGGTCACCCAGGTATTCCAGGTAACCCTGGTCATAATGGTCTGCCAGGTAGAGATGGTCGTGATGGTGCCAAAGGTGACAAAGGTGATGCTGGAGAGCCAGGTAGACCAGGTTCACCTGGTAAGGATGGAACCTCTGGTGAGAAGGGAGAACGTGGTGCCGACGGTAAAGTGGAAGCCAAGGGTATCAAGGGTGACCAGGGTTCTCGTGGTTCTCCAGGTAAACACGGTCCTAAAGGTTTGGCCGGTCCTATGGGAGAAAAGGGTCTGAGAGGTGAGACTGGTCCACAGGGACAGAAAGGTAACAAGGGTGACGTTGGTCCTACTGGTCCTGAGGGTCCTCGTGGTAATATTGGTCCACTGGGTCCTACCGGTCTGCCAGGTCCAATGGGTCCAATTGGTAAGCCAGGTCCAAAGGGTGAAGCTGGTCCTACCGGACCACAGGGAGAACCAGGTGTGCGTGGTATTAGAGGTTGGAAGGGTGATCGTGGAGAGAAGGGTAAAATCGGTGAGACCCTGGTGCTGCCAAAATCTGCCTTTACCGTTGGTCTGACCGTGCTGTCTAAGTTTCCTTCTTCTGATATGCCAATTAAATTTGACAAAATTCTGTACAACGAGTTCAACCATTATGACACTGCCGCCGGTAAGTTCACCTGCCATATCGCCGGTGTTTACTACTTTACCTATCATATTACCGTGTTCTCTCGTAACGTTCAGGTGTCTCTGGTGAAGAACGGTGTGAAGATCCTGCACACCAAGGACGCCTACATGTCTTCTGAGGACCAGGCTTCTGGTGGTATCGTGCTGCAGCTGAAACTGGGTGATGAGGTGTGGCTGCAGGTTACTGGTGGTGAACGTTTCAACGGTCTGTTTGCCGACGAAGATGACGACACCACCTTCACTGGATTCCTGCTGTTCTCATCTCCTTAA)，将合成的基因连接于pET30a(+)，采用IPTG(终浓度1mM)进行25℃，200rpm过夜诱导表达，4000g离心收获菌体。超声破碎后，12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化，采用咪唑浓度梯度洗脱后，通过透析更换为PBS缓冲液，采用MilliporeUtral-15浓缩，除去内毒素后，即为重组人CTRP9蛋白(参见图1)。选取6-8周龄Balb/C雌性小鼠，前述CTRP9蛋白作为抗原，为获得高亲和力抗体，采用小剂量(约1μg)、长时程，多次免疫的方法，选择免疫10天后，采用间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)，效价达到1∶5万以上准备融合。取经加强免疫的小鼠脾脏，研磨破碎，过滤洗涤之后，制成细胞悬液并计数；骨髓瘤SP2/0细胞生长至对数期，离心收集并洗涤，与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合，室温下采用PEG进行促融合，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后，依次采用5×HAT选择培养液、1×HAT/HT选择培养液和1×HT培养液进行融合骨髓瘤细胞筛选。采用间接ELISA方法阳性克隆(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)并进行连续克隆化。最终筛选得到能够稳定分泌抗CTRP9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为XA272-907和XA272-919，均保藏于中国典型培养物保藏中心,地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号分别为：CCTCCNO:C2016110和CCTCCNO:C2016111。实施例2：人CTRP9单克隆抗体XA272-919的制备编号为CCTCCNO:C2016111的杂交瘤细胞以106个/只的量，腹腔注射预先致敏8-10周龄BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M，pH4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃静置其充分沉淀。离心后取上清过滤，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)，并用2MNaOH调节pH至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀，离心后取沉淀，用含有0.2mMEDTA磷酸盐缓冲液溶解，并透析过夜。采用离子交换层析进行纯化，所用缓冲液：平衡缓冲液为20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0MNaCl的20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液。NaCl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白，检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。抗体的测序由北京安必奇生物科技有限公司完成，其步骤为：杂交瘤细胞采用RPMI1640加20％血清培养24h，离心，弃去上清，采用TriZol重悬细胞，106个细胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR扩增重链和轻链基因，克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为：单克隆抗体XA272-919，抗体序列为：重链可变区：QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS；CDR1序列：TYNIH；CDR2序列：AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT；CDR3序列：GGNAMDY；轻链可变区：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK；CDR1序列：KSSRTLLYSSNQKNYLA；CDR2序列：WASTRES；CDR3序列：LQYYSYVT。实施例3：人CTRP9单克隆抗体XA272-907的制备保藏号为：CCTCCNO：C2016110(保藏地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏时间：2016年6月16日)杂交瘤细胞以106个/只的量，腹腔注射预先致敏8-10周龄BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M，pH4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃静置其充分沉淀。离心后取上清过滤，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)，并用2MNaOH调节pH至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀，离心后取沉淀，用含有0.2mMEDTA磷酸盐缓冲液溶解，并透析过夜。采用离子交换层析进行纯化，所用缓冲液：平衡缓冲液为20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0MNaCl的20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液。NaCl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白，检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。抗体的测序由北京安必奇生物科技有限公司完成，其步骤大致为：杂交瘤细胞采用RPMI1640加20％血清培养24h，离心，弃去上清，采用TriZol重悬细胞，106个细胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR扩增重链和轻链基因，克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为：抗体XA272-907，该抗体的序列为：重链可变区：DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNFSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCACFDYWGQGTSLTVSS；CDR1序列：NFSWH；CDR2序列：YIHYSGGTNYNPSLKSRIS；CDR3序列：FDY；轻链可变区：DVLMTQTPLSLPVILGAQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK；CDR1序列：RSSQTIVHSNGNTYLE；CDR2序列：KVSNRFS；CDR3序列：FQGSHVPFT。实施例4:人CTRP9ELISA试剂盒试剂盒组成：人CTRP9单克隆抗体XA272-919包被的酶标板，标准品(纯化的CTRP9蛋白，冻干粉)，检测抗体：抗体XA272-907，酶标亲和素HRP-链霉素，样品稀释液，TMB酶底物显色液，洗涤液及反应终止液。TMB酶底物显色液：0.03％过硼酸钠，用之前10min加入TMB盐酸盐，终浓度0.01％；反应终止液：1mol/L硫酸溶液；样品稀释液：含0.1％BSA及0.1％Tween-20的PBS缓冲液；洗涤液:含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液。(1)酶标板包被：(1.1)杂交瘤细胞株XA272-919所产生单克隆抗体XA272-919作包被用抗体，用50mM、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至2μg/mL加至96孔板，100μL/孔，4℃包被过夜；(1.2)洗涤：用300μL含0.1％吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次，甩干；(1.3)干燥保存：存于加干燥剂的密封袋中，4℃保存备用。(2)检测抗体酶标辣根过氧化物酶(HRP)5mg/1mL加入0.2mL0.1M过碘酸钠，室温下避光搅拌20min。将上述溶液对1mMpH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。20μL0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液调节pH到9.0-9.5加入10mg抗体XA272-907(由杂交瘤细胞株XA272-907产生)，室温避光轻轻搅拌2h。加0.1mL硼氢化钠溶液(4mg/mL)，混匀静置2小时，4℃透析过夜。逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液4℃静置1小时，离心30min，弃去上清。沉淀物少量0.15MpH7.4的磷酸盐缓冲液并透析，上清即为酶标抗体XA272907-HRP(3)样品加入：将标准品(待测样本)加入包被孔内，室温振荡反应1h。(4)酶联反应：洗涤4次后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体XA272907-HRP100μl/孔，反应1h。(5)显色反应：洗涤4次后再加入底物液(含0.03％过硼酸钠和0.01％盐酸TMB)100μl，振荡显色10分钟。(6)终止反应：以1mol/L硫酸终止反应。(7)拟合曲线与读值：在酶标仪上读波长为405nm的OD值得出标准曲线和浓度。利用标准品测定本试剂盒相关指标：1.线性范围：该试剂盒检测CTRP9含量的线性范围为8.0pg/ml～15ng/ml。2.回收率：采用1ng/ml，10ng/ml，15ng/ml的CTRP9溶液(溶剂为样品稀释液)，测的平均回收率为98.87％(n＝9)。3.批内差异：平均为4％。4.批间差异：平均为8％。实施例5：用本发明试剂盒检测急性心肌梗死患者及正常对照组血清中CTRP9含量采用本发明所述试剂盒，检测50例正常人和50例急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量，其结果如表1所示。表1血清中CTRP9的检测结果(x±s，ng/ml)血清中CTRP9含量正常组急性心肌梗死患者ng/mL7.04±1.563.04±2.31P<0.001急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量明显低于正常人，差异显著(p＜0.01)。以上结果表明，利用本发明试剂盒能定量检测出体液标本中CTRP9的含量，对临床检测具有较高的敏感性和特异性，对诊断该病具有重要参考价值，为及早防治该病提供了一个有效途径。当前第1页1 2 3