本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，具体涉及一种利用荧光微卫星标记鉴定倒刺鲃家系的方法。
背景技术：
倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus denticulatus)，隶属鲤形目(Cyprinfomres)、鲤科(Cyprindae)、鲃亚科(Barbinae)、倒刺鲃属(Spinibarbus)，俗称青竹鲤，主要分布于我国珠江水系的北江、西江和东江的中上游，以及海南岛的昌化江、南渡江，是珠江水系优质经济鱼类。因其生长快、体型大、食性杂、肉质好、抗病力强等特点，是一个很有推广前途的养殖品种。
目前倒刺鲃繁殖亲本主要来自野生或培养数代的种群，没有经过人工选育，导致苗种种质退化加剧。常规苗种生长速度缓慢，其生长速度、抗病能力和其他养殖性能等还未达到良种化的程度，以及普遍存在近亲繁殖的现象，病害爆发等问题日益凸显；同时也在一定程度上影响倒刺鲃在更大范围内的推广。因此，尽快开展倒刺鲃良种选育工作加强倒刺鲃种质资源检测和评估，选育出生长快、抗逆性好的优良品种，对于倒刺鲃种群保护和满足集约化养殖业的迫切需要具有重要的意义。
家系选育是获得优良品种的重要手段。家系选育过程中，保持完整、准确的系谱信息可以有效指导亲本选育，从而避免近交衰退现象。传统的水产动物选择育种中，通常是将不同的家系分养在不同的分养池中以维持家系信息。这种方法由于不同分养池间的环境因子存在差异等，这可能会导致育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定。
在混合养殖群体中，通常是通过物理标记如：剪鳍、烙印、挂牌、荧光染料等保持家系信息，但这些物理标记同样存在诸多问题，使用物理标记存在操作繁琐、易损伤鱼体、标记存在时间不长及不易于在仔、稚鱼上进行标记等缺点。
随着科学技术的发展，分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。
微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等特点，为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。目前已在草鱼、黄颡鱼、大鳞鲆和凡纳滨对虾等水产经济动物中证实了微卫星在水产动物中家系鉴定的可行性及应用价值。目前尚未见微卫星标记应用于倒刺鲃家系鉴定的报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种倒刺鲃微卫星家系鉴定方法，应用于倒刺鲃亲子鉴定、种质管理、家系管理和评价增殖放流效果等。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种倒刺鲃微卫星家系鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将来自自然群体的倒刺鲃亲本进行人工繁育，得到2个家系，待鱼苗孵化出三个月后分别取30尾以上的鱼苗作为亲子鉴定的家系群体；
(2)随机选取步骤(1)中亲本和子代群体的鱼苗，以它们的鳍条组织提取基因组DNA；
(3)设计并合成一系列倒刺鲃微卫星引物序列，并对步骤(2)的基因组DNA进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性高、杂合度高的引物；共筛选出以下9对倒刺鲃微卫星引物：SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36；
SPMi1的序列分别如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；
SPMi7的序列分别如SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8所示；
SPMi15的序列分别如SEQ.ID.NO.13和SEQ.ID.NO.14所示；
SPMi18的序列分别如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；
SPMi23的序列分别如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示；
SPMi24的序列分别如SEQ.ID.NO.11和SEQ.ID.NO.12所示；
SPMi31的序列分别如SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.16所示；
SPMi33的序列分别如SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18所示；
SPMi36的序列分别如SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6所示；
(4)将步骤(3)筛得的9对倒刺鲃微卫星引物组合成3个多重PCR体系，多重PCR体系1包括SPMi1、SPMi23、SPMi36；多重PCR体系2包括SPMi7、SPMi18、SPMi24；多重PCR体系3包括SPMi15、SPMi31、SPMi33，其中每一对引物的正向引物的5’端标记上荧光标记；然后用3个多重PCR体系分别对步骤(2)的基因组DNA进行PCR扩增，得到多重PCR产物；
所述引物SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36的正向引物5’端标记的荧光标记分别是TAMRA、HEX、HEX、FAM、FAM、TAMRA、TAMRA、FAM、HEX；
多重PCR体系1的总体积20μl，包括基因组DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi1正反引物各0.2μl，SPM23、SPMi36正反引物各0.4μl，补充灭菌双蒸水至20μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存；
多重PCR体系2的总体积20μl，包括基因组DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi7、SPMi18正反引物各0.2μl，SPMi24正反引物各0.4μl，补充灭菌双蒸水至20μl，PCR反应条件与多重体系1的完全相同；
多重PCR体系3除引物之外的PCR体系和反应条件与多重PCR体系1的完全相同；
(5)将3组多重PCR产物在ABI3730xl分析仪上进行基因分型，读取个体等位基因大小，并对数据进行分析，根据待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系；
所述的对数据进行分析是用软件CERVUS3.0进行分析。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用微卫星标记与多重荧光PCR技术结合，筛选了9个高度多态性微卫星位点，组建3个多重荧光PCR体系，通过ABI3730xl分析仪分型，利用CERVUS3.0软件对倒刺鲃家系进行个体识别和亲子关系分析。
2、本发明一次PCR反应可以检测3个微卫星位点，效率较之以前提高了三倍，费用下降为原来的三分之一左右。
3、本发明通过毛细管电泳利用测序仪分型，克服了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型中等位基因大小判读误差的问题，大大提高了基因型数据的准确性。
4、本发明方法的建立为倒刺鲃的家系管理、种质管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一种倒刺鲃微卫星家系鉴定方法，包括以下步骤：
1)倒刺鲃家系的构建
从倒刺鲃自然群体(北江韶关段)中挑选优良父母本，通过注射激素的方法进行人工催产。通过1雄配1雌的方法构建了两个倒刺鲃全同胞家系。剪取繁殖亲本的臀鳍鳍条40mg左右，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。将不同家系分养在不同分养池中，待喂养三个月后，每个家系随机选取30尾子代，剪取倒刺鲃40mg左右尾鳍组织，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。
2)倒刺鲃亲本和子代基因组DNA提取
利用上海生工生物工程公司的“Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒”提取倒刺鲃亲本和子代基因组DNA。用NanoDrop-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量，检测后将DNA样品稀释至20ng/μl。
3)多态性微卫星标记的筛选
设计并合成系列引物，并分别对10个倒刺鲃个体(以步骤(2)的基因组DNA)进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性高、杂合度高的引物；
共筛选出9对倒刺鲃微卫星引物：SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36。
4)倒刺鲃微卫星多重PCR条件的优化和扩增
将上述筛选出来的9对引物，组合成3个多重PCR，多重PCR体系1包括引物SPMi1、SPMi23、SPMi36；多重PCR体系2包括引物SPMi7、SPMi18、SPMi24；多重PCR体系3包括引物SPMi15、SPMi31、SPMi33，其中每一对引物的正向引物的5’端标记上荧光标记；SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36的荧光标记分别是：TAMRA、HEX、HEX、FAM、FAM、TAMRA、TAMRA、FAM、HEX，见表1。
然后用3个多重PCR体系分别对步骤(2)的基因组DNA进行PCR扩增，得到多重PCR产物；
表1 倒刺鲃3个多重荧光PCR体系的引物序列及荧光标记
注：F表示正向引物，R表示反向引物，荧光标记均标记在正向引物的5’端。
多重PCR体系1的总体积为20μl，包括基因组DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi1正反引物各0.2μl，SPM23、SPMi36正反引物各0.4μl，补充灭菌双蒸水至20μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
多重PCR体系2的总体积为20μl，包括基因组DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi7、SPMi18正反引物各0.2μl，SPMi24正反引物各0.4μl，补充灭菌双蒸水至20μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
多重PCR体系3的总体积为20μl，包括基因组DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi15正反引物各0.2μl，SPM31、SPMi33正反引物各0.4μl，补充灭菌双蒸水至20μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
表2 倒刺鲃亲子鉴定的多重微卫星荧光标记PCR反应体系
5)微卫星位点基因分型及亲子鉴定
将上步骤获得的三组PCR样品分别利用ABI3730xl分析仪进行微卫星分型，LIZ500荧光分子作为内标。利用GeneMapper V1.75软件对微卫星分型数据进行读取，结合人工加以校正，排成数字基因型矩阵。
采用CERVUS 3.0对基因数据进行等位基因频率分析包括各微卫星位点的等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，接着进行模拟分析以及亲子鉴定分析。通过似然率(LOD)检验待测个体与亲本基因型之间的关联性，并在95％置信水平下，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系。
6)结果
利用9个微卫星位点对58尾子代和4尾亲本进行扩增和基因分型，基因型应用CERVUS 3.0软件分析结果如表3。为保证鉴定结果准确，根据LOD值鉴定候选父母本时，只有比家系记录数据一致，并且LOD大于0的才确认亲子关系。最终确认了57尾子代，鉴定准确率为98.3％。以上结果表明，利用本发明的微卫星多重荧光PCR方法能高效快捷实现倒刺鲃家系的亲子鉴定分析、种质管理和增殖放流效果评估的要求。
表3 9个微卫星位点在倒刺鲃家系中的检测参数
注：Na为等位基因数目；Ho为观测杂合度；He为期望杂合度；PIC为多态信息含量；HW为哈温
平衡；Fn为无效等位基因频率；ns表示不显著，*表示P<0.01，经Bonferroni校正。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。