核酸提取、扩增及检测集成装置及其制造方法和检测方法与流程

本发明涉及一种核酸提取、扩增及检测集成装置及其制造方法和检测方法。

背景技术：

核酸作为一种分子标志物已被广泛的用于疾病诊断，食品安全检测和环境监测领域。基于核酸的诊断一般包括核酸的提取、扩增和检测三个部分。传统的方法主要在实验室依赖于大型仪器和专业的技术人员，存在成本昂贵，耗时耗力等缺点。而在传染性疾病频发、食品安全问题突出、环境污染严重的偏远地区，这些传统的方法并不适用，因此严重耽误了该地区人们对疾病的诊断与治疗、食品的检测和环境的监控与治理。

近年来，随着纸基微流体技术的发展，低成本、微型化、携带方便、操作简单的纸基即时检测装置日渐受到人们的关注。目前，市面上已有纸基的提取方法(如：Whatman公司发明的纸上提取核酸的方法(如：FTA卡等))和纸基的核酸扩增与试纸检测方法(如：BioHelix发明的the BESt cassette产品，包括扩增槽和检测室)。它们都需要进行复杂的提取和扩增操作，还要依赖于实验室的大型仪器(如：热循环仪，冰箱)，仍然存在不便于携带、操作复杂、成本昂贵等缺陷。不能实现快速、简单、便携的核酸检测。仍然不适用于资源匮乏地区进行分子诊断。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有纸基核酸提取、扩增和检测方法存在的缺陷，提供一种核酸提取、扩增及检测集成装置及其制造方法和检测方法，该装置成本低廉、操作简单，携带方便，且检测时间短，无需专业技术人员进行操作，效率高，适用范围广。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

核酸提取、扩增及检测集成装置，包括上下扣合的上盖和基座，基座上设置有纸基核酸提取模块、纸基核酸等温扩增模块和试纸检测模块；上盖上开设有用于滴加样品的进样孔、控制按钮以及试纸结果观察窗；纸基核酸等温扩增模块上设置有能够移动的U型夹，上盖的侧面开设有用于固定U型夹的固定孔；U型夹包括上下两层紧密叠加在一起的能够导热的金属片，其中一端为拖动端，另一端为纸片区；纸片区的上层镶嵌有冻干的依赖解旋酶的等温扩增试剂的纸片，下层的相应位置上镶嵌有核酸吸附纸，拖动端由固定孔伸出；

核酸提取时，纸基核酸提取模块上的纸基裂解通道的末端与核酸吸附纸相接触，且纸片不与核酸吸附纸相接触；

等温扩增时，纸基核酸等温扩增模块上的加热片与核酸吸附纸和纸片相接触，核酸吸附纸和纸片上设置有起密封作用避免核酸扩增时气溶胶污染的PMMA板；

检测时，核酸吸附纸位于试纸检测模块上的试纸条和层析液存储槽之间，并与二者相接触。

本发明进一步的改进在于：

所述纸基核酸提取模块包括清洗液储液池和裂解液储液池，清洗液储液池的下端与纸基清洗通道的入口相连，裂解液储液池的下端与纸基裂解通道的入口相连；纸基裂解通道的下方设置吸水垫；纸基清洗通道的末端设置纸基阀门，在清洗时，纸基阀门与纸基裂解通道相接触，将纸基清洗通道和纸基裂解通道相连通。

所述清洗液储液池和裂解液储液池内均设置有密封橡胶和海绵，海绵位于密封橡胶的下方。

所述纸基核酸等温扩增模块还包括与加热片相连的电源，加热片采用陶瓷加热片。

所述试纸检测模块包括侧流层析试纸条和层析液存储槽，层析液存储槽位于侧流层析纸条的末端下方；侧流层析纸条与上盖上的试纸结果观察窗的位置相对应。

所述侧流层析纸条包括依次层叠设置的背胶板、样品垫、结合垫以及醋酸纤维素膜；层析液存储槽内放置有用于存储层析液的海绵。

一种核酸提取、扩增及检测集成装置的制备方法，包括以下步骤：

1)采用3D打印技术制备上盖和基座；

2)用激光切割机制备海绵、橡胶密封垫、PMMA板和绝缘疏水纸；

3)将储液海绵分别浸泡于相对应的液体中使海绵充满液体；

4)根据纸基模块的尺寸，用激光切割机制备相应尺寸的纸基通道，用打孔器制备纸基通道和核酸吸附纸；

5)用线切割机床制备U型夹的铜片；

6)用冷冻干燥的方法制备依赖解旋酶的等温扩增试剂纸片；

7)用纳米金标记检测探针，组装粘贴试纸，用切割机制备侧流程析试纸条；

8)将组成纸基核酸提取模块、纸基核酸等温扩增模块和试纸检测模块的储液海绵、密封橡胶、纸基通道、陶瓷加热片、钮扣电池、绝缘疏水纸、PMMA板、U型夹、侧流程析试纸条和层析液储存海绵分别安装于基座上；

9)将上盖和基座扣合组装形成纸基核酸提取、扩增及检测集成装置。

一种核酸提取、扩增及检测方法，包括以下步骤：

1)将样品滴加在进样孔处；

2)按下上盖的控制按钮，等待2分钟后，提取完成；

3)用手拖动U型夹到扩增指示线位置处，此时U型夹上的纸片区与加热片紧密接触，紧接着抽掉电池槽处的绝缘纸，开始核酸扩增，等待60分钟后，扩增完成；

4)再次拖动U型夹到检测指示线位置处，此时U型夹上的纸片区使分隔的层析液存储槽中的海绵和试纸条的样品垫相连接，样品靠毛细作用力层析到试纸条上，等待15分钟后，检测完成；

5)通过试纸结果观察窗观察检测结果，对照区域和检测区域均为红色时，判定为阳性结果，对照区域为红色时，判定结果为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明具有无需额外仪器、成本低廉、携带方便、操作简单、快速等优点。1)利用计算机软件设计装置结构，将核酸提取、扩增及检测集成于一个装置内，实现了样品进到结果出的一体化检测；2)此装置只需简单的四部操作：加样→按压提取控制按钮→拖动U型夹到扩增指示线→拖动U型夹到试纸指示线，整个检测只需要77分钟(传统实验室检测需要4-5小时)，无需专业技术人员进行操作，解决了操作简单、快速的问题。3)纸基提取模块和试纸检测模块与海绵结合解决了提取液和层析液的存储问题。同时，采用冻干技术将tHDA扩增试剂存储在纸上，无需低温冰箱。另外，扩增加热采用陶瓷加热片依靠纽扣电池提供电源，无需大型的加热装置。而纸基模块中，液体靠毛细作用力往前流动，无需外接泵，因此以上方法解决了携带方便的问题。4)此装置所选用的部件和化学反应试剂成本低廉，解决了降低成本的问题。

【附图说明】

图1为本发明所述纸基核酸提取、扩增及检测集成装置上盖结构示意图；

图2为本发明所述纸基核酸提取、扩增及检测集成装置基座结构示意图；

图3为本发明所述纸基核酸提取、扩增及检测集成装置集成模块(纸基提取模块、纸基核酸扩增模块和试纸检测模块)结构示意图；

图4为本发明所述纸基核酸提取、扩增及检测集成装置基座及其集成模块的示意图；

图5为利用本发明检测不同浓度沙门氏菌的检测结果。

其中，1-进样孔；2-控制按钮；3-固定孔；4-试纸结果观察窗；5-清洗液储液池；6-裂解液储液池；7-储液孔；8-纸基裂解通道；9-纸基清洗通道；10-吸水垫；11-核酸吸附纸；12-纸片；13-加热片；14-电源；15-PMMA板；16-U型夹；17-层析液存储槽；18-试纸条。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1-4，本发明纸基核酸提取、扩增和检测集成装置，包括采用3D打印技术打印的光固化树脂材质的上盖、基座和基座上的集成模块，上盖是扣压在基座上。上盖包括进样孔1、固定在上盖上的控制按钮2、固定“U”型夹的孔3和试纸结果观察窗4。基座上集成模块包括纸基核酸提取模块、纸基核酸等温扩增模块和测试纸检测模块。

纸基核酸提取模块包括直径为12mm的清洗液储液池5和直径为9mm的裂解液储液池6，清洗液储液池5和裂解液储液池6均由海绵和密封橡胶组成，海绵在下，密封橡胶在上；其中每个储液池与纸通道相连的位置开有尺寸为5mm×2mm的储液孔7，储液孔7分别与纸基裂解通道和纸基清洗通道相联；裂解通道8一端与裂解液储液池6相连，一端与核酸吸附纸相连，清洗通道9一端与清洗液储液池5相连，另一端由纸基阀门组成，与纸基裂解通道相连实现多步操作；核酸吸附纸11被固定在U型夹的下层与纸基裂解通道的一端相连，而U型夹的上层通过一个小梁被隔在上面，在核酸提取过程中不与核酸吸附纸相接处；吸水垫10在核酸吸附纸下面。

纸基裂解通道8和纸基清洗通道9的材质选用普通的滤纸，其进样区采用直径为5mm～8mm的滤纸，纸基裂解通道8的尺寸为25mm×5mm，纸基清洗通道9的尺寸为10mm×5mm。核酸吸附纸选用玻璃纤维，其尺寸为5mm×7mm，吸水垫选用吸水纸，其尺寸为30mm×20mm。

纸基核酸等温扩增模块包括超薄的陶瓷加热片、镶嵌有纸的可移动U型夹16、提供电源14的电池和覆盖在加热片上的塑料板。其中U型夹材质为二层可导热的金属片紧密叠加在一起，其尺寸为8mm×100mm。其中距离U型夹10mm处开有5mm×7mm的小口，上层镶嵌有冻干的依赖解旋酶的等温扩增tHDA试剂的纸片12尺寸为5mm×7mm，下层相应位置镶嵌有核酸吸附纸11尺寸为5mm×7mm，同时，上层金属片上有两条黑色的指示线，分别为距离拖动端47mm的扩增指示线和距离拖动端62mm的检测指示线；提供电源的电池选用直径为12mm的3V钮扣电池，在未进行扩增时，在基座上安放电池槽底部开有一5mm×2mm的小口用于放置绝缘纸来阻断电源与电线之间的导通，覆盖在加热片上的塑料板选用尺寸为25mm×30mm的PMMA板15，此板是为了避免核酸扩增时的气溶胶污染。

试纸检测模块包括侧流程析试纸条18和层析液储存槽17。其侧流程析试纸由有尺寸为60mm×3mm的背胶板、15mm×3mm的样品垫、10mm×3mm的结合垫及20mm×3mm的醋酸纤维素膜层叠构成，吸水纸为尺寸为6mm×14mm的“T”型，层析液存储槽放置了尺寸为10mm×5mm×5mm的海绵用来存储层析液。

本发明还提供了一种纸基核酸提取、扩增及检测的集成装置的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用计算机软件设计上盖和基座的结构，将设计好的上盖和基座结构导入3D打印软件中，用3D打印机分别打印。

(2)用激光切割机制备相应尺寸的海绵、橡胶密封垫、PMMA板和绝缘疏水纸；

(3)将储液海绵分别浸泡于相对应的液体中使海绵充满液体；

(4)根据纸基模块的尺寸，用激光切割机制备相应尺寸的纸基通道，用打孔器制备进样区滤纸片和核酸吸附区玻璃纤维片。

(5)用线切割机床制备U型夹的铜片。

(6)用冷冻干燥的方法制备依赖解旋酶的等温扩增tHDA试剂纸片。

(7)用纳米金标记检测探针，组装粘贴试纸相关成分，用切割机制备侧流程析试纸条。

(8)将纸基核酸提取模块中的相应部件储液海绵，密封橡胶，纸基通道，纸基核酸扩增模块的相应部件陶瓷加热片，钮扣电池，绝缘疏水纸，PMMA板，镶嵌有核酸吸附纸和冻干的依赖解旋酶的等温扩增tHDA试剂的纸片的U型夹和试纸检测模块的相应部件侧流程析试纸条和层析液储存海绵分别放置于相应的位置。

(9)将集成装置中的每个部件分别粘贴于基座的相应位置；

(10)将上盖和基座组装形成纸基核酸提取、扩增及检测集成装置。

本发明还提供了一种采用上述集成装置进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)将样品滴加在进样孔1处。

(2)按下上盖的控制按钮2，等待2分钟后，提取完成。

(3)用手拖动U型夹到扩增指示线位置处，此时U型夹上的纸片与加热片紧密接触，紧接着抽掉电池槽处的绝缘纸，开始核酸扩增，等待60分钟后，扩增完成。

(4)再次拖动U型夹到检测指示线位置处，此时U型夹上的纸片区使分隔的层析液海绵和试纸条的样品垫相连接，样品靠毛细作用力层析到试纸条上，等待15分钟后，检测完成。

(5)通过试纸结果观察窗观察检测结果，对照区域和检测区域均为红色时，判定为阳性结果，对照区域为红色时，判定结果为阴性。

本发明样本的提取流程：把样品从进样孔滴加进去，按下控制按钮，这样控制按钮会和密封圈一起挤压海绵，使海绵中的液体从与纸通道相连的小孔处流出，通过毛细作用力一直到达核酸捕获区再到吸水垫上。等待2分钟后，提取工作完成。然后，用手拖动U型夹到扩增指示线，同时，抽掉电池槽背后的绝缘纸，等待60分钟后，扩增完成。紧接着，再次拖动U型夹到检测指示线，靠毛细作用力进行检测，15分钟后在试纸结果观察窗观察检测结果。

为了验证此装置的可行性，采用不同浓度的沙门氏菌样品进行提取、扩增和检测，结果见图5，浓度为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹(CFU/ml)的样本对照区域和检测区域均为红色，判定为阳性结果，10⁰和NC对照区域为红色时，检测区域无颜色，判定结果为阴性。

综上所述，本发明装置在使用时整个过程需要大约70min、操作简单仅需4步(加样→按压提取控制按钮→拖动U型夹到扩增指示线→拖动U型夹到试纸指示线)、便于携带。与现有检测方法相比，此装置解决了储液问题，降低了成本和减少复杂多步操作，不需要使用大型的仪器和专业的技术人员就可以完成。本发明在未来可用于资源匮乏地区以实现现场快速检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。