一个影响猪生长和PRRSV抗性的分子标记、检测方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及一个影响猪生长和PRRSV抗性的分子标记、检测方法及其应用。

背景技术：

由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种高度传染的病毒性疾病，主要以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征，造成怀孕母猪的流产、死胎以及仔猪生长缓慢、高死亡率等。该病于20世纪80年代末在美国发现，随后在荷兰、西班牙、英国等养猪业发达国家相继爆发，造成了巨大的经济损失。1991年荷兰科学家Wensvoort博士第一次从感染的猪体内分离出这种病毒，并将其命名为Lelystad病毒(LV)。1992年美国科学家Collins等在CL2621细胞中分离到能够导致相似临床症状的病毒，并将其命名为VR-2332毒株。1992年，世界动物卫生组织正式将该病毒统一命名PRRSV。我国初次发生该病是在1995年，郭宝清等人在1996年首次分离到该病毒，命名为CH-1a株。2006年在我国爆发的猪高热病其主要病原即为高致病性PRRSV。目前，PRRS严重威胁着全球养猪业，并给养猪业带来了巨大的经济损失。由于PRRSV具有高度变异性、抗体依赖性病毒复制增强等特征，现有的疫苗并不能很好地控制该疾病的流行，通过遗传抗性的选择，培育PRRSV抗性猪新品种(系)成为重要的方向。抗病性状属于阈性状，生长性状属于数量性状，二者都是重要的经济性状，同时也是表型选择准确性差、遗传进展慢的性状，开发相应的分子标记，进行标记辅助选择，可以实现超早期选种，提高选择的准确性，加快育种进程。

猪白细胞抗原DRB1(Swine leukocyte antigen DRB1，SLA-DRB1)，又名主要组织相容性抗原DRB1(MHC-DRB1)。SLA定位于7p12-q12，按其抗原结构和功能主要分为3大类，即I类、Ⅱ类和III类基因，其中Ⅱ类基因位于SLA-D区，主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等，控制着机体的免疫应答与调控。其中，存在于DR亚区的DRB基因第2外显子编码区是SLA抗原分子最重要的功能区，即抗原结合区。SLA-DRB1与抗原递呈中Ia分子相关的不变链(Ia-associated invariant chain,Ii链)、伴侣分子SLA-DM及TCR一起完成抗原的递呈与识别。

研究显示,DRB基因第2外显子区具有高度多态性。如鞠慧萍等以藏猪为研究材料对SLA-DRB基因第2外显子多态性进行了研究，发现藏猪SLA-DRB基因外显子2存在着高度的多态性，在RsaⅠ-RFLP位点上存在7种基因型，以杂合子BC型居多，等位基因B的频率最高，这一结果与谈永松等研究五指山、二花脸和皮特兰猪的SLA-DRB基因外显子2多态性时仅检测到4种带型(AA，BB，AB和BD)，且A为优势等位基因有一定的差异。徐如海(2004)采用直接测序法研究表明，SLA-DRB外显子2中的多态位点高达62个,SLA-DRB外显子2中位点29与仔猪大肠杆菌K88ad粘附表型存在显著的关联(p＜0.01),位点29,149,170对0-28日龄仔猪血清IgG含量有显著影响(p＜0.05)；同时在SLA-DRB近端调控区发现了24个多态位点,但这些多态位点与仔猪大肠杆菌K88ab,K88ac,K88ad粘附表型没有显著的关联(p＞0.05)。另外，有报道SLA-DRB1编码区多态性与免疫伪狂犬病毒疫苗产生的抗体滴度有关。但SLA-DRB1多态性与PRRSV抗性的关联尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服猪育种中生长和PRRSV抗性表型选择准确性低，成本高，遗传进展慢的缺点，提供一个影响猪体重和PRRSV抗性的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种猪生长性状和PRRSV抗性性状的SLA-DRB1基因启动子区分子标记选择方法，用于猪分子育种，可以提高猪生长性状和PRRSV抗性性状选择的准确性，降低育种成本，加快猪PRRSV抗性新品种(系)培育进程。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个影响猪体重和PRRSV抗性的分子标记，所述分子标记位于猪SLA-DRB1基因启动子区-58位点，且具有C/T多态性，CC型体重显著高于CT型和TT型，仔猪感染PRRSV后CC型猪血液中病毒载量低于CT型和TT型。

本发明所述的分子标记在猪分子育种中的应用。

一种用于检测本发明所述的分子标记的引物对，上游引物P1如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的引物对在猪分子育种中的应用。

一种检测本发明所述的分子标记的方法，包含PCR扩增猪基因组中含有本发明所述的分子标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读猪SLA-DRB1基因启动子区-58位点的C/T多态性。

一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，包括利用本发明所述的引物对PCR扩增猪基因组中含有本发明所述的分子标记的一段序列，利用KpnⅠ限制性内切酶对所述的扩增产物进行酶切、电泳分型，获得216bp、31bp两个片段的定义为CC型，获得247bp、216bp、31bp三个片段的定义为CT型，获得247bp片段的定义为TT型。

一种筛选高生长性状和具有PRRSV抗性的猪品系的方法，包括检测猪SLA-DRB1基因启动子区-58位点的多态性，选择CC型个体留种。

本发明所述的方法，优选包括以下步骤：

1)提取猪基因组DNA；

2)利用本发明所述的引物对PCR扩增SLA-DRB1基因启动子区序列(序列NC_010449.4，20052～20298bp区域)，得到247bp扩增产物；

3)利用KpnⅠ限制性内切酶对所述的扩增产物进行酶切、电泳分型，获得216bp、31bp两个片段的定义为CC型，获得247bp、216bp、31bp三个片段的定义为CT型，获得247bp片段的定义为TT型；

4)CC型体重显著高于CT型和TT型，仔猪感染PRRSV后CC型猪对PRRSV的抗性高于CT型和TT型，选择CC型个体留种。

其中，所述PCR扩增的反应总体系优选为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl₂ 1.2-1.6μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。

所述酶切的反应体系优选为10-16μL，PCR产物3-5μL，10U/μL KpnⅠ酶0.2-0.5μL，10×缓冲液1.0-1.6μL，补充灭菌双蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。

有益效果

猪的生长性状是一个重要的经济性状，属于数量性状，传统的表型选择准确性低，周期长，无法进行超早期选择，遗传进展缓慢。而常规的PRRSV抗性选择需要进行PRRSV攻毒实验，需要建立专门的试验场所，攻毒实验严重影响猪生长，部分攻毒猪死亡，代价很高，周期长，选择准确性低，遗传进展缓慢。本发明采用PCR-RFLP方法检测SLA-DRB1基因启动子区-58C/T KpnⅠ酶切位点的多态性，并将基因型与猪体重、猪对PRRSV的抗性进行关联分析，发现SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点的多态性与猪体重、猪对PRRSV的抗性相关，CC型猪群25、29、32、36、39、46、53、60、67日龄体重均极显著高于CT型和TT型，CC型猪群接种PRRSV后不同时间点血液中PRRSV相对量均低于CT型和TT型，并且在接种PRRSV后第4、7天CC型显著低于TT型，接种后第11天CC型显著低于CT型(p＜0.05，表2)，表明CC型猪对PRRSV具有更高的抗性。该多态位点可用于猪生长和PRRSV抗性的辅助选择，提高选择的准确性，同时可以在猪出生时就通过检测基因型进行选择，无需攻毒测试，加快育种进程，降低育种成本，对PRRSV抗性新品种(系)培育具有重要的价值。

附图说明

图1猪SLA-DRB1基因启动子区-58C/T突变位点测序图

图2猪SLA-DRB1基因启动子区-58C/T突变位点电泳分型图

如图所示：泳道M为DL500marker，CC、CT、TT分别表示猪SLA-DRB1基因启动子区PCR扩增产物经KpnⅠ酶切后分为CC、CT、TT基因型。

具体实施方式

下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法，内切酶和荧光定量PCR试剂购自大连宝生物有限公司，高纯总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其余试剂购自南京生兴生物技术有限公司。

实施例1、猪生长和PRRSV抗性的SLA-DRB1基因启动子区-58C/T SNPs分子标记选择方法

材料与方法：

(一)猪群

88头健康的大白姜曲海杂交猪(不接种任何疫苗)来自江苏省农业科学院，经PCR检测血液中无PRRSV，经ELISA检测血液中无PRRSV抗体。

(二)方法

1、猪对PRRSV抗性的测试方法

25日龄仔猪测体温、称重、采血，每头猪耳根肌肉注射高致病性PRRSV NJGC株(TCID₅₀为10^-6.88/0.1mL)2mL，分别在29(接毒后4天)、32(接毒后7天)、36(接毒后11天)、39(接毒后14天)、46(接毒后21天)、53(接毒后28天)、60(接毒后35天)、67日龄(接毒后42天)测量体温、体重、采集血液(肝素钠抗凝)2mL，提取总RNA，以管家基因β‐actin为内参，实时荧光定量PCR测定PRRSV-N基因的绝对量或者相对量，本案例中以ln2^-△△CT表示病毒载量。

2、DNA的提取

采用常规酚、氯仿法提取DNA，采用电泳及测定OD₂₆₀/₂₈₀检测DNA质量。

3、总RNA提取

本案例中以全血提取总RNA，采用北京百泰克生物技术有限公司高纯总RNA快速提取试剂盒。提取方法参照试剂盒使用手册，略作修改。200μL抗凝血加入600μL裂解液RL混匀，其余操作同试剂盒说明书。采用电泳及测定OD₂₆₀/₂₈₀检测RNA质量。

4、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

总RNA参照RT Master Mix(TAKARA公司)试剂盒说明书逆转录合成cDNA。根据GenBank中PRRSV NJGC株序列(EF534357)利用引物设计软件Primer5.0设计一对特异性引物(序列为P3：TCGCCCAACAAAACCAGT(SEQ ID NO.3)，P4：TTACCCTCCCTGAATCTGACA(SEQ ID NO.4))，根据GenBank中β-actin序列(AY550069)设计一对特异性引物(序列为P5：CCAAAGCCAACCGTGAGAA(SEQ ID NO.5)，P6：CCAGAGGCGTACAGGGACA(SEQ ID NO.6))，使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(TAKARA公司)，以管家基因β-actin为内参，进行实时荧光定量PCR，对PRRSV N基因的mRNA水平表达量进行检测。

在避光环境、冰上进行操作，20μL Real-time PCR反应体系为：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、0.8μL上游引物(10μM)、0.8μL下游引物(10μM)、0.4μLROX Reference Dye II(50×)、2μL cDNA模板、6μL ddH₂O。每组设3个重复，反应程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；每个循环结束后收集荧光信号。每个样本三次重复取平均值，使用ln2^-△△CT法计算PRRSV N基因的相对量作为病毒载量。

5、SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点序列的扩增

根据genebank序列NC_010449.4，利用Primer Primer 5设计一对特异性引物(序列为P1：TTCGGTATGTGGGTGGAGGAGGGCCACGGTA(SEQ ID NO.1)，P2：TGGCAACTCCCCTCCTTCCCCACCC(SEQ ID NO.2))，PCR扩增SLA-DRB1基因启动子区序列(序列NC_010449.4，20052～20298bp区域)。

PCR反应总体系20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl₂ 1.4μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。

6、PCR扩增产物的KpnⅠ酶切分型。酶切的反应体系为10-16μL，PCR产物3-5μL，10U/μL KpnⅠ酶0.2-0.5μL，10×缓冲液1.0-1.6μL，补充灭菌双蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，凝胶成像系统拍照。

7、SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点不同基因型猪群间体重、PRRSV抗性的差异显著性分析，采用SPSS 10中的One-way ANOVA方法进行。

(三)结果与分析

1、SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点KpnⅠ酶切多态性

88个样本的PCR扩增产物经KpnⅠ酶切出现3种基因型，获得216bp、31bp(图1，31bp片段由于分子量太小，电泳图未显示)两个片段的定义为CC型；获得247bp、216bp、31bp(同上)三个片段的定义为CT型，获得247bp片段的定义为TT型。

2、SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点不同基因型猪群间体重差异显著性分析

采用单因素方差分析比较不同基因型猪群间体重的差异发现，CC型猪群25、29、32、36、39、46、53、60、67日龄体重均极显著高于CT型和TT型(p＜0.01，表1)。

表1 SLA-DRB1基因启动子区-58bp位点不同基因型杂交猪群体重变化

注:同行不同大写字母上标表示差异极显著(p<0.01)。

3、SLA-DRB1基因启动子区-58C/T位点不同基因型猪群间PRRSV抗性的差异显著性分析

采用单因素方差分析比较不同基因型猪群接毒后血液中PRRSV相对量的差异发现，CC型猪群接种PRRSV后不同时间点血液中PRRSV相对量均低于CT型和TT型，并且在接种PRRSV后第4、7天CC型显著低于TT型，接种后第11天CC型显著低于CT型(p＜0.05，表2)，表明CC型猪对PRRSV具有更高的抗性。

表2 SLA-DRB1基因启动子区-58bp位点不同基因型杂交猪群接毒后血液中PRRSV相对量

注:同行不同小写字母上标表示差异显著(p＜0.05)。

综合分析以上结果可以看出，CC型猪在体重和对PRRSV的抗性方面均具有优势，可以作为猪生长和PRRSV抗性性状选择的分子标记，在留种时选择CC型个体。