技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种利用肿瘤细胞（如：人髓系白血病细胞系K562，人肺小细胞肺癌细胞系A549，人宫颈癌细胞系Hela，人肝癌细胞系HepG2等所有可以进行大规模培养的肿瘤细胞系）来源外泌体（Exosomes）制备肿瘤特异性DC-CTL的方法。
背景技术：
CTL是“cytotoxic lymphocyte”的缩写，中文全称为“细胞毒性T淋巴细胞”。DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)，DC能够处理包括肿瘤抗原在内的抗原并加以提呈，同时，未成熟DC发生了一系列的变化，获得成熟表型及功能。而CTL是外周血淋巴细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD8+CD28+细胞为主要效应细胞的细胞群，具有强大的抗肿瘤活性，能够通过释放颗粒酶、穿孔素杀伤靶细胞，或者通过FasL依赖的方式使靶细胞凋亡。DC-CTL是将DC和T细胞在体外共培养，然后回输给患者的一种免疫治疗细胞。DC与初始T细胞相遇，表面的MHC-I-抗原肽复合物激活T细胞的TCR，同时成熟DC表面高表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体结合，诱导其活化成CTL并大量增殖，并获得特异性杀伤肿瘤细胞的能力。CTL具有显著的增殖能力和特异性杀伤肿瘤的效应，且该效应安全无毒，几乎没有不良反应，在临床试验过程中极大地改善了肿瘤患者的生存质量。
然而，在临床试验中发现DC-CTL技术仍然存在局限性，主要有杀伤强度和特异性不足的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用肿瘤细胞来源外泌体（Exosomes）制备特异性DC-CTL的方法，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用肿瘤细胞来源外泌体（Exosomes）制备肿瘤特异性DC-CTL的方法，包括步骤：
A）制备肿瘤细胞来源的外泌体（Exosomes）；
B）制备外周血单个核细胞（PBMC）；
C）分离单核细胞和淋巴细胞；
D）单核细胞和淋巴细胞添加因子；
E）制备肿瘤细胞来源Exosomes的DC-CTL。
制备肿瘤细胞来源的外泌体（Exosomes）：取肿瘤细胞培养上清液2ml，3000g离心15分钟后取上清到混合的Exosomes试剂混合液（A:B:C=1:1:4)中，离心后分成，取中间层（白膜层）到PBS中，充分吹打和振荡后，5000g离心5分钟，取上清到Exosomes分离柱中，1000g离心3分钟后，底部液体就是Exosomes的纯液；
制备外周血单个核细胞（PBMC）：采取健康志愿者的外周血，肝素抗凝，应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞，用AIM-V培养基重悬细胞；
分离单核细胞和淋巴细胞： PBMC用AIM-V培养基重悬后放培养箱培养3小时后把悬浮的细胞转到另一个培养瓶中，即为淋巴细胞，底下贴壁的即为单核细胞；
单核细胞和淋巴细胞添加因子：淋巴细胞：第0天加入CTL1因子，于第1天加入CTLq因子；单核细胞，需要在第0天加入DCq因子，于第5天加入DC3因子；
进一步，所述的CTL1因子添加浓度为0.1ug/ml，CTLq因子为CTL2(2万IU/ml)+CTL3因子(2ug/ml)+ CTL4因子(0.02ug/ml)+ CTL5因子(2ug/ml)；单核细胞添加因子：DCq因子为DC1因子（2ug/ml）+DC2因子（0.014ug/ml），DC3因子（0.1ug/ml）；
添加Exosomes到DC中孵育：分离得到单核细胞培养到第5天诱导成为DC，按照浓度1-10ug /105cell添加Exosomes与DC共孵育，在37度培养箱培养；
制备肿瘤细胞来源Exosomes的DC-CTL：DC和CTL培养至第7天，收集2种细胞共培养，注意DC是贴壁的，需要用细胞刮把培养瓶内所有的DC刮起来，分别转到CTL培养瓶中。此时的CTL具备了肿瘤抗原特异性。
所述肿瘤细胞为人髓系白血病细胞系K562，人肺小细胞肺癌细胞系A549，人宫颈癌细胞系Hela，人肝癌细胞系HepG2等所有可以进行大规模培养的肿瘤细胞系来源的肿瘤细胞。
本发明通过肿瘤来源的Exosomes来解决肿瘤免疫治疗的特异性不足的难题，Exosomes是活细胞在生理状态下分泌的，经由内体途径形成的多囊泡体（MVB）与细胞膜融合释放到胞外的具有脂质双分子层膜的囊泡，直径大小为30-100 nm之间，密度为1.13g/ml-1.21g/ml，标志性分子主要有HSP70、CD63、Alix、TSG101、CD9等，主要是通过试剂盒或者~100,000 g超速离心的方式收集。Exosomes被认为不仅是细胞清除废旧蛋白质的工具，更重要的是作为细胞与细胞间的蛋白质、脂质和核酸类信息交流的重要信使。由于肿瘤细胞来源的Exosomes是内体途径生成的，包含有细胞膜来源和细胞质来源的分子，除了含有普通Exosomes含有的蛋白质，还含有大量能够反映其来源的肿瘤特异性抗原。Exosomes与DC接触后可通过被内吞或者膜融合的方式被DC完全摄取、处理并提呈给 T细胞，促进其活化并杀伤肿瘤细胞。研究表明，利用肿瘤细胞来源的Exosomes冲击DC得到的CTL的杀伤效率比传统采用肿瘤细胞的裂解物、肿瘤抗原多肽的方法更有效。由于Exosomes具有脂质双分子层膜，因此其中的抗原表位保存完整、抗原谱全面，且Exosomes的提取较为简便，来源也较为广泛。利用肿瘤细胞来源的Exosomes来增强DC-CTL对肿瘤杀伤的特异性，优化这一具有强大潜力的肿瘤免疫治疗技术，为肿瘤的免疫治疗提供新思路。
本发明优点在于：
1)肿瘤细胞来源的Exosomes中的抗原表位保存完整、抗原谱全面。2)Exosomes的提取较为简便，来源也较为广泛，肿瘤细胞系可大规模培养，其上清可收集到大量Exosomes。3)本发明利用肿瘤细胞来源的Exosomes制备肿瘤特异性DC-CTL，充分发挥了肿瘤细胞来源的Exosomes携带肿瘤抗原的优势，通过DC呈递给CTL，使之能特异性地识别并杀伤肿瘤靶细胞，有效地清除体内残留的病灶。4)利用肿瘤细胞来源的Exosomes制备肿瘤特异性DC-CTL，比传统采用肿瘤细胞的裂解物、肿瘤抗原多肽的方法更有效。
附图说明
图1为本发明步骤流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照本领域普通技术人员采用的常规方法和试剂厂家提供的操作说明执行。
实施例1
一种利用肿瘤细胞来源外泌体（Exosomes）制备特异性DC-CTL的方法,如图1所示，所述的制备方法包括以下步骤：
步骤1、采取健康志愿者的外周血，肝素钠抗凝，应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞，0.9%生理盐水洗涤后，用AIM-V培养基重悬细胞。
步骤2、将细胞接种于培养瓶中，置于37OC，5%CO2培养箱孵育2小时后，收集贴壁细胞和悬浮细胞。
步骤3、将悬浮细胞用10%自体血浆的AIM-V培养基培养，调整细胞密度1－2X106个/ml，添加CTL诱导因子，CTLq因子为CTL2(2万IU/ml)+CTL3因子(2ug/ml)+ CTL4因子(0.02ug/ml)+ CTL5因子(2ug/ml), 刺激诱导为CTL。
步骤4、将贴壁的细胞加入DC培养基，在第0天加入DCq因子（DC1因子（2ug/ml）+DC2因子（0.014ug/ml）），诱导DC。
步骤5以人非小细胞肺癌细胞系A549为例，制备肿瘤细胞系A549来源的外泌体（Exosomes），取肿瘤细胞A549培养上清70ml，500g离心15分钟，取上清，上清经0.22μm滤器过滤， 然后100,000g， 1h，4℃离心，弃去上清，用无菌PBS重悬沉淀，再次100,000g， 1h，4℃离心，弃去上清，用适量无菌PBS重悬沉淀，即为粗提的Exosomes。将粗提的 exosomes 置于连续的密度梯度（1.07、1.09、1.11、1.13、1.15、1.17、1.19、1.21g/ml）的蔗糖溶液上，进行超速离心 100,000g，2h，4℃离心，然后将1.13-1.19 g/ml之间层的液体吸出，加入PBS，再次进行超速离心100,000g，1h，将得到的沉淀用适量无菌PBS重悬，即为exosmes纯液。
步骤6第5天加入DC3因子（0.1ug/ml），将收集到的Exosomes和DC共培养，按照浓度1－10ug/105cell添加Exosomes，在37度培养箱培养，得到肿瘤特异的DC。
步骤7第7天收集带有肿瘤特异性抗原的DC和CTL共培养，每3天补加1000IU/ml rhIL-2的AIM-V培养基，共培养到14天，即可得到肿瘤特异的DC-CTL。
实施例2
作为对照实验，采用DC-CTL常规方法制备，步骤如下：
步骤1、采取健康志愿者的外周血，肝素钠抗凝，应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞，0.9%生理盐水洗涤后，用AIM-V培养基重悬细胞。
步骤2、将细胞接种于培养瓶中，置于37OC，5%CO2培养箱孵育2小时后，收集贴壁细胞和悬浮细胞。
步骤3、将悬浮细胞用10%自体血浆的AIM-V培养基培养，调整细胞密度1－2X106个/ml，添加CTL诱导因子，CTLq因子为CTL2(2万IU/ml)+CTL3因子(2ug/ml)+ CTL4因子(0.02ug/ml)+ CTL5因子(2ug/ml),刺激诱导为CTL。
步骤4、将贴壁的细胞加入DC培养基，在第0天加入DCq因子（DC1因子（2ug/ml）+DC2因子（0.014ug/ml）），诱导DC。
步骤5、第5天DC培养体系中加入DC3因子（0.1ug/ml）在37度培养箱培养。
步骤6、第7天收集DC和CTL共培养，每3天补加1000IU/ml rhIL-2的AIM-V培养基，共培养到14天，即可得到DC-CTL。
实施例3
特异性的DC-CTL和常规的DC-CTL相关指标检测对比
1.无菌和热源检测：
经检测，实施例1和2所制备的DC－CTL无菌试验和热源试验均为阴性。2.细胞增殖活性检测：
经多次结果检测，实施例1细胞增长倍数高于比实施例2的增长倍数，为传统方法的3－5倍。
3.细胞表型检测：
用流式细胞仪检测细胞表型，实施例1制备的DC-CTL中CD3+CD8+CD28+细胞比例比实施例2高2－3倍。
4.DC-CTL杀伤癌细胞效率检测：
以淋巴癌细胞A549为靶细胞，实施例1方法制备的具有淋巴癌抗原特异的DC-CTL的杀瘤效率为85%±0.5%，实施例2制备的DC-CTL的杀瘤率为53%±0.7%，因此，本发明制备的特异性DC-CTL比传统制备方法得到的DC-CTL的杀瘤效率高了30%。