细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的制作方法

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母及构建方法及应用。

背景技术：

白色污染是全球所有城市都存在的一种环境污染，主要是指人们在日常生活中随意丢弃的塑料垃圾对环境造成的破坏，包括常见的塑料杯、一次性饭盒、塑料袋等。这些塑料类产品以石油为原料，采用聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等高分子化合物制成，难以进行降解，再加上生活中的塑料包装大多呈白色，被人们使用并随意丢弃后会呈现出丑、脏、乱、杂等无秩序、不协调的特点，干扰和刺激人们的视觉，让人产生厌烦心理，所以被称为白色污染。而白色污染物的很大一部分是PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年产量达到了2700多万吨，虽然PET不会直接对环境造成危害，但其废弃物对大气和微生物的抵抗性很强，在自然环境中的存在周期为16-48年，而且随着PET产业的快速发展，其废弃物的数量极其巨大，从环境行为和生态效应考虑，PET废弃物已成为全球性的环境污染有机物。

目前降解PET的方法主要有化学降解和生物降解两大类，在实际应用中PET的化学分解法主要有水解法和醇解法，此外还有氨解、胺解和热解等。但是这些方法通常成本较高、效率较低并且不环保，避免不了降解PET后给环境带来二次污染；而生物降解方法相对化学降解工艺更简单、更节能环保、且不会造成二次污染。因此生物降解将是从根本上解决废弃PET污染的最好方法。

聚对苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)是目前唯一一个在细菌中发现的能降解PET的酶，分子量约为32KD，能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸，其最大的优势是，与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低温段(20～40℃)的酶活显著高于其他酶，这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件，工业应用前景较好。

疏水蛋白HGF1/HFB1是一种丝状真菌产生的小分子量(12KD左右)蛋白质，最主要的功能之一就是能够自主装在任何亲/疏水界面形成一层两亲性的膜来改变界面的性质，并且该蛋白具较强耐高温、耐酸碱和较低免疫原性等的特点。但目前尚未有细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组菌的报道。

参考文献：

[1]Shosuke Yoshida,Kazumi Hiraga,Toshihiko Takehana,Ikuo Taniguchi,Hironao Yamaji,Yasuhito Maeda,Kiyotsuna Toyohara,Kenji Miyamoto,Yoshiharu Kimura,Kohei Oda.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.

[2]Li Xiuhua,Wang Ziying.Research Progress on Degradation of PET[J].塑料科技，2011(4):110-114.

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。

本发明的第二个目的是提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建。

本发明的第三个目的是提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的应用。

本发明的技术方案概述如下：

细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建，包括如下步骤：

(1)从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因；化学合成疏水蛋白基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因；

(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因连接得到融合序列2；

(3)将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体2；

(4)将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。

锚定蛋白基因优选：SEQ ID No.3所示的GCW51、SEQ ID No.4所示的GCW61或SEQ ID No.8所示的GCW21。

疏水蛋白基因优选SEQ ID NO.2所示的HGF1基因、SEQ ID NO.9所示的HFB1基因、SEQ ID NO.10所示的SC3基因或SEQ ID NO.11所示的HFB2基因。

毕赤酵母表达载体优选：ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC。

上述构建方法构建的细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。

上述细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母在全细胞催化分解PET的用途。

本发明的有益效果：

本发明应用整合载体进行表达，避免了选择压力且载体不容易丢失。当PETase在细胞表面表达时，相当于做了酶的固定化，将其固着定位于细胞表面。经固定化后的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，避免了蛋白纯化的繁琐。而利用疏水蛋白与PETase在毕赤酵母中进行共展示，由于疏水蛋白具有双亲性，会自发以亲水面与酵母细胞表面结合，疏水面朝外，增强重组毕赤酵母的稳定性。

附图说明

图1为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot图；其中：

图1A为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的Western Blot图；

图1B为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot图。

图2为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的相对酶活。

图3为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫荧光检测结果图；其中：

图3-1为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的免疫荧光检测结果图；

图3-2为重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫荧光检测结果图；

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

锚定蛋白GCW21(NCBI Reference Sequence:XM_002491407)；

锚定蛋白GCW51(NCBI Reference Sequence:XP_002493782)；

锚定蛋白GCW61(NCBI Reference Sequence:XP_002494322)序列。

毕赤酵母GS115(pichia pastoris GS115)市售。也可以用其它的毕赤酵母应用于本发明。

ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC，均为市售。

大肠杆菌(E.coli)DH5α，市售。

实施例1 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的制备及应用：

一、从毕赤酵母GS115基因组中克隆出如SEQ ID No.3所示的GCW51锚定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因；具体步骤如下：

毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中，过夜培养，离心收集细胞，利用提基因组试剂盒提取得到GS115酵母菌基因组DNA。

根据如SEQ ID No.3所示的GCW51序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物51-F/61-F和下游引物51-R/61-R，其中划线部分为酶切位点，以P.pastoris GS115基因组DNA为模板，扩增GCW51、GCW61基因。

51-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGATGACGATGACTCATTAC

51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得GCW51基因、GCW61基因。

二、化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.3所示的GCW51锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

根据化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的

PETase基因，设计上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，其中下划线部分为酶切位点，以合成序列为模板扩增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

将所得PETase与GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HGF1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr。

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤如下：

将PETase-linker-GCW51基因和ppic9载体同时用Xho I和EcoR I双酶切后，将得到的酶切PETase-linker-GCW51基因片段连接到双酶切后的ppic9载体上；将HGF1-linker-GCW61基因和ppiczaA载体同时用EcoR I和Not I双酶切后，将得到的酶切HGF1-linker-GCW61基因片段连接到双酶切后的ppiczaA载体上；将上述两种连接产物分别转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得连接有PETase-linker-GCW51的融合表达载体p9P51(融合表达载体1)和连接有HGF1-linker-GCW61基因的融合表达载体pAHG61(融合表达载体2)。

用Xho I和EcoR I双酶切质粒p9P51，并用1％琼脂糖凝胶电泳验证；用EcoR I和Not I双酶切质粒pAHG61并用1％琼脂糖凝胶电泳验证；

在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用thermo公司的T4DNA连接酶进行连接。

在上述步骤中，所述的连接产物的大肠杆菌的转化，按如下方法进行：

(1)取一管感受态细胞E.coli DH5α于冰上缓慢溶解，加入要转化的质粒或连接产物(10μL)，轻混后冰浴30min；

(2)42℃热激90s后，迅速冰浴5min；

(3)加入900μL，37℃温浴的LB培养基，37℃摇床培养1h；

(4)取200微升涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB选择平板(对于p9P51载体而言)和含zeocin(25μg/mL)的LB选择平板(对于pAHG61载体而言)上，37℃倒置培养12-16h；

(5)挑取单克隆，进行后续质粒提取以及验证实验。

在上述步骤中，所述的连接产物阳性克隆验证，按如下方法进行：

(1)从筛选平板上挑取p9P51转化子，接入5mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床培养12-16h；从筛选平板上挑取pAHG61转化子，接入5mL低盐LB液体培养基(氯化钠浓度为普通LB培养基一半)中(含25μg/mLzeocin)，37℃、避光摇床培养12-16h

(2)取5mL菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；

(3)取1μL质粒提取液进行Nanodrop检测，检测提取的质粒浓度；

(4)将提取的质粒进行双酶切，验证基因片段与载体的连接效果；

(5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序或者进行其他实验，测序委托金唯智生物公司完成。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1，具体步骤如下：

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P51载体和pAHG61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株为细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW51-HGF1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-51-F/R以及hg-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-51-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六、细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris

PETase-GCW51-HGF1的应用，具体步骤如下：

Western Blot实验

一、P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的SDS－PAGE电泳

二、转膜

(1)转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套。

(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和膜。

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫三层滤纸。

(4)要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在转移液中进行。

(5)将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1h。

三、免疫反应

(1)将膜转移至含有封闭液的盒中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h后,用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(2)将一抗用PBST稀释至适当浓度，4℃过夜孵育后,用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(3)将二抗用PBST稀释至适当浓度，室温下孵育1h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

四、化学发光，显影，定影

图1A的结果说明PETase和HGF1在重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1成功表达。

HPLC测酶活实验

配置酶活反应所用到的一系列Buffer PBS缓冲液：用800ml双蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽滤除菌。

Glycine/NaOH Buffer：0.2M Glycine溶液50ml；0.2M NaOH溶液8.8ml

混匀定容200ml，互相调pH到9.0

磷酸磷酸二氢钠缓冲液pH＝2.50：0.02M H3PO4 1L；0.02M NaH2PO4 1L，

在1L烧杯中先加200～300ml磷酸，再往里兑磷酸二氢钠，直到pH＝2.50

甲醇：甲醇一瓶为500ml,直接将两瓶抽滤到一个1L的大瓶子里，有机滤纸。

终止液：90mL PBS+10mL DMSO

1.制样(设置1个实验组和1个对照组)。

a.取适量P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌液于EP管，3000g，4℃离心5min，去上清。

b.加入适量甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH＝9.0)重悬菌液，离心去上清。

c.重复一次。

d.设置不同P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌量梯度(2ml、1ml、0.5ml、0.1ml、0.01ml)。

e.加入100微升甘氨酸氢氧化钠缓冲液重悬菌液。

2.实验组加入提前处理好的PET膜，对照组不加PET膜

3.在恒温摇床里40℃，18h，220rpm孵育反应。

4.冻菌：剩余菌体用PBS洗两次，用20％甘油重悬，冻存。

5.反应结束后，4℃5000g离心10min

6.取上清，加入终止液

7.85℃灭活10min

8.12000rpm，离心10min，取100微升于新的EP管内。

9.将配好的磷酸/磷酸二氢钠缓冲液(pH＝2.5)和甲醇超声30min。

10.过HPLC，上样100微升，记录好顺序。

图2的结果说明重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1能降解PET，且较野生型PETase酶活有显著提升。

免疫荧光检测

(1)取200uLP.pastoris PETase-GCW51-HGF1诱导培养液于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。

(2)PBS缓冲液对重组酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1细胞进行重悬，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。

(3)利用200uL的3mg/mLBSA的PBS缓冲液重悬菌体，于室温下反应1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。

(4)利用含1uL一抗的200uL的3mg/mLBSA的PBS缓冲液重悬菌体，于4℃过夜处理，期间应使菌体上下混匀。次日于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。

(5)PBS缓冲液对重组酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1细胞进行重悬，室温处理10min，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。

(6)步骤(5)重复两次。

(7)利用含1uL二抗的200uL的PBS缓冲液重悬菌体，避光室温处理1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。

(8)PBS缓冲液对重组酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1细胞进行重悬，避光室温处理5min，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。

(9)步骤(8)重复一次。

(10)用200uL的PBS缓冲液重悬，每次取10uL于洁静载玻片制片。

图3-1的结果说明PETase基因成功展示在重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1表面。

实施例2 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris

PETase-GCW51-HFB1的制备及应用，包括如下步骤：

一、同实施例1步骤一。

二、化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.3所示的GCW51锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

根据化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，设计上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，其中下划线部分为酶切位点，以合成序列为模板扩增PETase基因和HFB1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

将所得PETase与GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HFB1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤见实施例1步骤四。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1，具体步骤如下：

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P51载体和pAHF61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW51-HFB1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW51-HFB1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-51-F/R以及hf-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-51-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

hf-61-F：CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

hf-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六、细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的应用，具体步骤同实施例1步骤六。

图1B的结果说明PETase和HFB1在重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1中成功表达。

图2的结果说明重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1能降解PET，且较野生型PETase酶活有显著提升。

图3-2的结果说明PETase基因成功展示在重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1表面。

用SC3疏水蛋白(SEQ ID NO.10)或HFB2疏水蛋白(SEQ ID NO.11)，替代本实施例的疏水蛋白基因HFB1，其它参照本实施例，制备出细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW51-SC3；或细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW51-HFB2。

实施例3 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1的制备及应用，包括如下步骤：

一、从毕赤酵母GS115基因组中克隆出如SEQ ID No.8所示的GCW21锚定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因；具体步骤如下：

毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中，过夜培养，离心收集细胞，利用提基因组试剂盒提取得到GS115酵母菌基因组DNA。

根据如SEQ ID No.8所示的GCW21序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物21-F/61-F和下游引物21-R/61-R，其中划线部分为酶切位点，以P.pastoris GS115基因组DNA为模板，扩增GCW21、GCW61基因。

21-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC

21-R:CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得GCW21基因、GCW61基因。

二、化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.8所示的GCW21锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

根据化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，设计上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，以合成序列为模板扩增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

将所得PETase与GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HGF1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤同实施例1步骤四。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1，具体步骤如下。

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P21载体和pAHG61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW21-HGF1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW21-HGF1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-21-F/R以及hg-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-21-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-21-R：CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC测酶活实验

操作步骤参照实施例1的HPLC测酶活实验，实验结果说明重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1能降解PET，且较野生型PETase酶活有显著提升。

实施例4 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1的制备及应用，包括如下步骤：

一、同实施例3步骤一；

二、化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.8所示的GCW21锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

根据化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，设计上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，以合成序列为模板扩增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

将所得PETase与GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HFB1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤同实施例1步骤四。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1，具体步骤如下。

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P21载体和pAHF61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW21-HFB1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW21-HFB1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-21-F/R以及hf-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-21-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-21-R：CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

hf-61-F：CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

hf-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC测酶活实验

操作步骤参照实施例1的HPLC测酶活实验，实验结果说明重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1能降解PET，且较野生型PETase酶活有显著提升。

实施例5 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1的制备及应用，包括如下步骤：

一、从毕赤酵母GS115基因组中克隆出如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因；具体步骤如下：

毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中，过夜培养，离心收集细胞，利用提基因组试剂盒提取得到GS115酵母菌基因组DNA。

根据如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物61-F’/61-F和下游引物61-R’/61-R，其中划线部分为酶切位点，以P.pastoris GS115基因组DNA为模板，扩增GCW61基因。

61-F’：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAG

61-R’：CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得GCW61基因。

二、化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

根据化学合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，设计上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，以合成序列为模板扩增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

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hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

将所得PETase与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HGF1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤同实施例1步骤四。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1，具体步骤如下。

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P61载体和pAHG61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW61-HGF1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW61-HGF1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-61-F/R以及hg-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-61-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-61-R：CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC测酶活实验

操作步骤参照实施例1的HPLC测酶活实验，实验结果说明重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1能降解PET，且较野生型PETase酶活有显著提升。

实施例6 细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1的制备及应用，包括如下步骤：

一、同实施例5步骤一。

二、化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将如SEQ ID No.4所示的GCW61锚定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列连接得到融合序列2，具体步骤如下：

化学合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，设计上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，以合成序列为模板扩增PETase基因和HFB1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

将所得PETase与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr；将所得HFB1与GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker为重叠区进行overlap pcr

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体ppic9上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体ppiczaA上，得到融合表达载体2，具体步骤同实施例1步骤四。

五、将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1，具体步骤如下。

电击法转化P.pastoris GS115细胞感受态制备

(1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

(2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；

(3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；

(4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；；

(5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。

电击法转化与转化子验证

(1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P61载体和pAHF61载体DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选，阳性菌落菌株细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，命名为P.pastoris PETase-GCW61-HFB1；

(5)提取转化子(P.pastoris PETase-GCW61-HFB1)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、P-61-F/R以及hf-61-F/R，对阳性菌进行甘油保菌。

P-61-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

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