一种诱导骨髓间充质干细胞分化成神经细胞的方法与流程

本发明涉及干细胞分化培养领域，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞分化成神经细胞的方法。

背景技术：

神经元损伤性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默疾病、脑缺血等)是当前困扰人类的重大疾病，目前没有任何药物能治愈神经元损伤性疾病，一些用于治疗该病的药物仅能在某种程度上减轻症状，且长期使用还会产生毒副作用。近年来，利用干细胞移植治疗神经元损伤性疾病得到了医学界的广泛关注。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因易于获取，免疫原性低，增殖能力强，具有多向分化的潜能性，且伦理学争议少而被寄予厚望。

如公告号为CN1549856的专利提供了一种使间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其包括在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养所述间充质干细胞，在该方法中间充质干细胞在培养开始大约4周后，才形成几个细胞组成的神经细胞集落，诱导分化效率较低。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种诱导骨髓间充质干细胞分化成神经细胞的方法，该方法能有效缩短间充质干细胞分化成神经细胞的时间，提高诱导分化效率。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种诱导骨髓间充质干细胞分化成神经细胞的方法，包括以下步骤：(1)间充质干细胞的制备；(2)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，待细胞生长汇合度达到60％-80％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；(3)加入0.25％胰蛋白酶消化3-5min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞，再将骨髓间充质干细胞移入离心管中，1500转离心5min，去除诱导培养基；(4)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔2-3天换一次诱导培养基；所述诱导培养基由基础培养基添加维A酸、2-巯基乙醇与叶酸后制得。

采用上述方案，维A酸是维生素A代谢的中间产物，其具有促使细胞增生分化的作用，将其加入细胞培养基体系后其具有促使骨髓间充质干细胞向神经细胞生长分化的作用；

2-巯基乙醇是一种有机化合物，其具有较强的抗氧化性，可防止蛋白质被氧化，从而在细胞培养体系中能增强细胞的抗氧化性，同时其具有促使骨髓间充质干细胞向树突状细胞分化的作用；

叶酸是一种水溶性的维生素，可有效预防胎儿神经管畸形，其在细胞培养体系中可有效减少神经细胞畸变的同时加快神经细胞的增值，保证细胞培养过程中神经细胞的活性；

维A酸与2-巯基乙醇在该细胞培养体系产生联合作用，共同促使骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，同时体系中叶酸的存在使得分化得到的神经细胞具有较强的活性，经多次试验证明，采用该方法诱导间充质干细胞分化成神经细胞，可在两周内就能得到网状相连的神经细胞。

作为优选，所述诱导培养基中维A酸的含量为10-50μg/ml，2-巯基乙醇的含量为60-95μg/ml，叶酸的含量为45-65μg/ml。

采用上述方案，经过多次试验证明，当诱导培养基中维A酸的含量为10-50μg/ml，2-巯基乙醇的含量为60-95μg/ml，叶酸的含量为45-65μg/ml时对骨髓间充质干细胞分化成神经细胞有着最好的诱导效果。

作为优选，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

采用上述方案，DMEM/F12培养基是将DMEM培养基与F12培养基1：1结合组成的培养基，其结合了DMEM培养基具有较高浓度的营养成分及F12含有多种细胞生长所需微量元素的特点，故其能保证骨髓间充质干细胞诱导分化过程的物质所需。

作为优选，所述基础培养基中添加有庆大霉素及氟喹诺酮，其中庆大霉素的浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的浓度为70μg/ml。

采用上述方案，庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成；

氟喹诺酮是一类化学合成抗菌药，其杀菌机理作用主要是通过细菌的细胞膜后作用于细胞内的DNA旋转酶，阻碍细胞膜DNA的正常复制、转录、转运与重组，从而造成细菌死亡；

培养基中同时加入庆大霉素及氟喹诺酮可有效减少培养基感染细菌的几率，保证培养细胞的正常生长。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

能有效提高骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效率，经试验证明，采用该方法诱导间充质干细胞分化成神经细胞，可在两周内就能得到网状相连的神经细胞。

附图说明

图1中1-A为实施例1中诱导12h后的细胞镜检状态，1-B为实施例1中诱导4d后的细胞镜检状态，1-C为实施例1中诱导7d后的细胞镜检状态，1-D为实施例1中诱导14d后的细胞镜检状态。

图2中2-A为实施例1NSE染色图片，2-B为实施例1NF染色图片，2-C为实施例1GFAP染色图片。

以上镜检照片放大细胞倍数均为200倍。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

(1)基础培养基制备，向DMEM/F12培养基中依次加入庆大霉素及氟喹诺酮，使培养基中庆大霉素的终浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的终浓度为70μg/ml；

(2)诱导培养基制备，向(1)中制备得到的基础培养基依次加入维A酸、2-巯基乙醇及叶酸，使培养基中维A酸的终浓度为10μg/ml，2-巯基乙醇的终浓度为95μg/ml，叶酸的终浓度为45μg/ml；

(3)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(4)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到60％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(5)加入0.25％胰蛋白酶消化3min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(6)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm2接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔2天换一次诱导培养基。

实施例2：

(1)基础培养基制备，向DMEM/F12培养基中依次加入庆大霉素及氟喹诺酮，使培养基中庆大霉素的终浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的终浓度为70μg/ml；

(2)诱导培养基制备，向(1)中制备得到的基础培养基依次加入维A酸、2-巯基乙醇及叶酸，使培养基中维A酸的终浓度为50μg/ml，2-巯基乙醇的终浓度为60μg/ml，叶酸的终浓度为65μg/ml；

(3)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(4)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到80％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(5)加入0.25％胰蛋白酶消化5min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(6)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔3天换一次诱导培养基。

实施例3：

(1)基础培养基制备，向DMEM/F12培养基中依次加入庆大霉素及氟喹诺酮，使培养基中庆大霉素的终浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的终浓度为70μg/ml；

(2)诱导培养基制备，向(1)中制备得到的基础培养基依次加入维A酸、2-巯基乙醇，使培养基中维A酸的终浓度为30μg/ml，2-巯基乙醇的终浓度为80μg/ml；

(3)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(4)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到70％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(5)加入0.25％胰蛋白酶消化5min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(6)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔3天换一次诱导培养基。

实施例4：

(1)基础培养基制备，向DMEM/F12培养基中依次加入庆大霉素及氟喹诺酮，使培养基中庆大霉素的终浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的终浓度为70μg/ml；

(2)诱导培养基制备，向(1)中制备得到的基础培养基依次加入2-巯基乙醇及叶酸，使培养基中2-巯基乙醇的终浓度为80μg/ml，叶酸的终浓度为55μg/ml；

(3)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(4)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到60％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(5)加入0.25％胰蛋白酶消化3min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(6)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔2天换一次诱导培养基。

实施例5：

(1)基础培养基制备，向DMEM/F12培养基中依次加入庆大霉素及氟喹诺酮，使培养基中庆大霉素的终浓度为50μg/ml，氟喹诺酮的终浓度为70μg/ml；

(2)诱导培养基制备，向(1)中制备得到的基础培养基依次加入维A酸及叶酸，使培养基中维A酸的终浓度为30μg/ml，叶酸的终浓度为55μg/ml；

(3)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(4)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至基础培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到60％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(5)加入0.25％胰蛋白酶消化3min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(6)在细胞培养器中加入诱导培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔2天换一次诱导培养基。

实施例6：

(1)骨髓间充质干细胞的制备，收集离体成人骨髓5ml，加入40ml磷酸缓冲液后，于1800rpm下离心5min；吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min；回收位于顶层和Ficoll层之间界面的单核细胞，加入40ml PBS，于1800rpm下离心5min，弃上清既得；

(2)将制备得到的骨髓间充质干细胞接种至DMEM/F12培养基中进行培养，肉眼观察，待细胞生长汇合度达到60％，吸去基础培养基后加入PBS缓冲液，轻轻清洗单层细胞，再吸去PBS；

(3)加入0.25％胰蛋白酶消化3min后，加入诱导培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞；

(4)在细胞培养器中加入DMEM/F12培养基后，按细胞密度5×10³cells/cm²接种细胞，将培养器置于37℃，6％CO₂的无菌培养箱中培养，每隔2天换一次DMEM/F12培养基。

实施例7：生存状态、活性比较及神经细胞标志物测定分析。

从实施例1-6中分别取诱导12h，1d，4d，7d，10d，14d的细胞制作细胞盖片，观察细胞形态，检测结果见表1，同时分别对实施例1-6中诱导了10d的细胞做神经元特异性标志(NSE与NF)及星形胶质细胞特异性标志(GFAP)做免疫细胞染色化学分析，分析结果见表2。

表1细胞形态变化记录

表2.神经细胞特异性标志细胞染色分析结果

实验分析：结合图1及表1可知当骨髓间充质干细胞细胞在同时添加有维A酸、2-巯基乙醇与叶酸的诱导培养基中只需要10-14天即可形成网状相连的细胞相比其他只添加有维A酸、2-巯基乙醇与叶酸中两种，同时结合图2及表2可知，形成的网状细胞确实为神经细胞，即采用该方法可在两周内即可诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化，诱导分化率高。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。