一种近红外荧光分子探针及其合成方法和应用与流程

本发明属于生化检测领域，特别涉及一种新的近红外荧光分子探针，还涉及该分子探针的制备方法及其在细胞成像中的应用。
背景技术：
：随着生命科学研究的快速发展，荧光分子探针在细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学等方面应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。近红外荧光探针发射波长处于650-900nm。它与紫外或者可见光区荧光分子探针相比，有低背景荧光干扰、强组织穿透力和对生物机体无光损伤等优势。因此发展具有良好生物相容性、量子产率高、化学及光稳定性好的水溶性近红外荧光探针成为目前生物诊断方向的研究热点。近红外荧光探针的种类很多，根据结构的不同可以分为芳酸菁类、花菁类、酞菁及其络合物、噻嗪类、嗯嗪类、罗丹明类、BODIPY类。其中花菁类染料由于摩尔吸收系数大，波长可调范围宽，荧光量子产率高以及无毒等优点，成为研究的热点。吲哚七甲川菁染料是菁染料中应用最为广泛的一类染料，主要用于肿瘤靶向检测、蛋白或核酸标记、微量金属离子或其他生物小分子等生物检测方面。近年来，吲哚七甲川菁染料的生物应用越来越多，通过向吲哚七甲川菁染料中引入活性基团或改变它们的结构母核，使新生成的荧光探针具有不同的生物功能，这已成为荧光成像技术的研究热点。吲哚七甲川菁染料中最具有代表性应用的最广的是吲哚菁绿(IndocyanineGreen，ICG)。1955年由美国柯达实验室研发，因其毒性低、副作用小，广泛用于心脏功能、肝功能和视网膜血管造影。最近，ICG也被用来作为一种潜在的光敏剂。然而ICG的应用也存在一定的限制如低量子产率，体内光不稳定性和在血管中的泄露等。因此，许多课题组开始研究ICG衍生物来提高体内外成像的亮度、溶解性、耐光性和光稳定性等。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种结构新颖的近红外荧光分子探针，能够增强荧光强度，提高细胞成像效果。本发明的另一个目的是提供所述近红外荧光分子探针的合成方法和应用。技术方案：本发明所述的近红外荧光分子探针，结构如式(Ⅱ)所示：本发明还提供了所述的近红外荧光分子探针的合成方法，包括：(1)有机溶剂中，在惰性气体保护下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐与间氟苄溴反应，得式(Ⅰ)化合物：(2)有机溶剂中，在惰性气体保护下，式(Ⅰ)化合物与2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯反应，得所述的式(Ⅱ)化合物。步骤(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐具体可以为2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，结构为：惰性气体可以为任何不参与反应的气体，如氮气、氩气等。步骤(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐与间氟苄溴的摩尔比为1：1-4；所述的有机溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、邻二氯苯和1,4-二氧六环中的一种或几种。步骤(1)中，反应温度为85-100℃，优选为90-100℃；反应时间为14-18h。步骤(2)中，式(Ⅰ)化合物与2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯的摩尔比为2～3:1。2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯的结构为所述的有机溶剂为乙醇、醋酸酐、吡啶、正丁醇和甲苯中的一种或几种。惰性气体可以为任何不参与反应的气体，如氮气、氩气等。步骤(2)中，还可以添加催化剂无水醋酸钠，催化剂的物质的量与式(Ⅰ)化合物的物质的量相同。步骤(2)中，反应温度为70～75℃，反应时间为4-8h。步骤(2)反应结束后，需在反应体系中纯化分离得所述的式(Ⅱ)化合物，所述纯化分离的方法包括：将反应后的溶液降至室温，减压浓缩后加入醚类溶剂，过滤，然后再经固体经色谱柱进行分离纯化，干燥得所述的式(Ⅱ)化合物。其中，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，优选乙醚、甲基叔丁基醚，醚类溶剂加入量可根据需要选择，优选地为减压浓缩后的反应液的体积的3-5倍。所述的色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比为8:1-12:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比2:1-4:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。本发明还提供了所述的近红外荧光分子探针在活细胞成像中的应用。所述的细胞具体可以为肺癌细胞如A549细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的近红外荧光分子探针，吲哚环上引入-SO3H这种强吸电子基团，能使甲川共轭链上的电子云密度减少，而在七甲川链两端周围空间引入了体积较大的苄基和卤素，增大染料的共轭体系，从而增大了染料的stock位移，进一步增强其分子荧光强度，改善其在细胞内的成像效果。本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测生物成像的近红外荧光探针。该荧光分子探针在分析化学、生命科学、环境科学等领域具有较强的实际应用价值。附图说明图1是本发明近红外荧光分子探针的1HNMR图；图2是本发明近红外荧光分子探针的MS图；图3a是本发明的近红外荧光分子探针的紫外吸收光谱图；图3b是本发明的近红外荧光分子探针的荧光发射光谱图；图4是本发明的近红外荧光分子探针对活的A549细胞的细胞毒性图；图5为本发明的近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像图；a是本发明的近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像图，b是与之对应的明场细胞成像图；c是吲哚菁绿在活的A549细胞内成像图，d是与之对应的明场细胞成像图。具体实施方式下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。本发明具体实施方式中近红外荧光分子探针的合成反应方程式如下：实施例1(1)向50ml单口烧瓶中分批加入4.47mmol2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾、5.81mmol间氟苄溴和12ml甲苯，在氩气的保护下，90℃反应14h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到1.31g1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸，为粉红色固体，产率84.4％。(2)取2.76mmol1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸、1.38mmol2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯和30ml正丁醇：甲苯(v/v)＝7:3的混合溶剂加入到100ml的反应瓶中，在氩气的保护下，75℃下加热回流反应5h，反应结束，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液3倍体积的甲基叔丁基醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.38g深绿色固体为近红外荧光分子探针，命名为IR787探针。收率：33.1％。产物氢谱谱图见图1，质谱谱图见图2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.73(s,14H),2.54-2.57(t,J＝4Hz,4H),5.50(s,4H),6.36–6.40(d,J＝14Hz,2H),7.02–7.04(d,J＝8Hz,2H),7.14–7.19(m,4H),7.33-7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.38-7.44(m,4H),7.625-7.629(d,J＝1.6Hz,1H),7.646-7.650(d,J＝1.6Hz,1H),7.85(s,2H),8.23–8.26(d,J＝14Hz,2H)。TOF-MSm/z：829.3[M+H]-。实施例2(1)向50ml单口烧瓶中分批加入4.47mmol2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾、8.94mmol间氟苄溴和24ml甲苯，在氩气的保护下，90℃反应16h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到1.21g1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸，为粉红色固体。(2)取2.76mmol1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸、1.38mmol2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯和20ml的吡啶加入到100ml的反应瓶中，在氩气的保护下，75℃下加热回流反应8h，反应结束，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液4倍体积的甲基叔丁基醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为12:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.20g深绿色固体为近红外荧光分子探针。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.73(s,14H),2.54-2.57(t,J＝4Hz,4H),5.50(s,4H),6.36–6.40(d,J＝14Hz,2H),7.02–7.04(d,J＝8Hz,2H),7.14–7.19(m,4H),7.33-7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.38-7.44(m,4H),7.625-7.629(d,J＝1.6Hz,1H),7.646-7.650(d,J＝1.6Hz,1H),7.85(s,2H),8.23–8.26(d,J＝14Hz,2H)。TOF-MSm/z：829.3[M+H]-。实施例3(1)向50ml单口烧瓶中分批加入4.47mmol2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾、11.62mmol间氟苄溴和24ml甲苯，在氮气的保护下，90℃反应15h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到1.28g1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸，为粉红色固体。(2)取2.76mmol1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸、1.38mmol2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯、2.76mmol无水醋酸钠和20ml的无水乙醇加入到100ml的反应瓶中，在氩气的保护下，75℃下加热回流反应4h，反应结束，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液5倍体积的甲基叔丁基醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.25g深绿色固体为近红外荧光分子探针。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.73(s,14H),2.54-2.57(t,J＝4Hz,4H),5.50(s,4H),6.36–6.40(d,J＝14Hz,2H),7.02–7.04(d,J＝8Hz,2H),7.14–7.19(m,4H),7.33-7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.38-7.44(m,4H),7.625-7.629(d,J＝1.6Hz,1H),7.646-7.650(d,J＝1.6Hz,1H),7.85(s,2H),8.23–8.26(d,J＝14Hz,2H)。TOF-MSm/z：829.3[M+H]-。实施例4(1)向50ml单口烧瓶中分批加入4.47mmol2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾、17.88mmol间氟苄溴和24ml甲苯，在氩气的保护下，90℃反应18h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到1.15g1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸，为粉红色固体。(2)取2.76mmol1-间氟苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸、1.38mmol2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯、2.76mmol无水醋酸钠和20ml的乙酸酐加入到100ml的反应瓶中，在氩气的保护下，75℃下加热回流反应5h，反应结束，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液3倍体积的甲基叔丁基醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.23g深绿色固体为近红外荧光分子探针。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.73(s,14H),2.54-2.57(t,J＝4Hz,4H),5.50(s,4H),6.36–6.40(d,J＝14Hz,2H),7.02–7.04(d,J＝8Hz,2H),7.14–7.19(m,4H),7.33-7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.38-7.44(m,4H),7.625-7.629(d,J＝1.6Hz,1H),7.646-7.650(d,J＝1.6Hz,1H),7.85(s,2H),8.23–8.26(d,J＝14Hz,2H)。TOF-MSm/z：829.3[M+H]-。实施例5本发明还合成了化合物1a，结构为：除原料外合成方法参照实施例1，具体合成路线如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.58(m,2H),1.72(s,12H),2.09(t,4H),5.52(s,4H),6.36-6.40(d,J＝13.6Hz,2H),7.26-7.40(m,12H),7.62-7.64(d,2H),7.85(s,2H),8.22-8.25(d,J＝13.6Hz,2H)。TOF-MSm/z:794.2[M+H]-。表1染料吸收波长(nm)发射波长(nm)斯托克斯(stokes)位移(nm)IR787787826391a78380320由表1的结果可知，化合物1a因其斯托克斯(stokes)位移非常小，在20nm左右，造成荧光自淬灭，IR787与其相比具有更好的效果。实施例6把探针用于活细胞成像时，首先要考虑到其生物相容性，因此我们用细胞毒性试验来检测不同浓度的IR787探针的细胞毒性。将生长良好的A549细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞，置于培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h；弃掉培养板中的溶液，分别设置空白对照组、阳性对照组(吲哚菁绿ICG)和IR787实验组，并加入相应受试物，继续孵育24h后；直接加入MTT溶液，每孔20ul置于培养箱中孵育4h；弃掉培养板中的溶液，加入DMSO溶液150ul/孔，置于微孔板振荡器内震荡10min；在酶标仪上测定490nm波长的每孔吸光值，并进行结果分析。实验结果见图4，结果表明，与ICG相比，IR787对A549细胞没有毒性，IR787浓度为10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、120nM处理24h后的细胞存活率分别为96.43％，102.42％，97.10％，94.58％，85.73％，79.69％。在最大浓度120nM，24h后，细胞活性仍大于75％。细胞毒性表明IR787在活细胞中没有明显的毒性，IR787探针有很好的生物相容性。实施例7应用本发明近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像，检测该探针是否能在生物体中成像。37℃在A549细胞中分别加入本发明近红外荧光分子探针(10μM)和ICG(10μM)孵育30min，然后用PBS缓冲溶液(0.1M，pH7.4)冲洗3遍。在激发波长为787nm下观察本发明探针在A549细胞中的荧光分布情况，在激发波长为805nm下观察ICG在A549细胞中的荧光分布情况。图3a、图3b是本发明近红外荧光分子探针和ICG的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。从图(5a，5c)中我们可以看到本发明近红外荧光分子探针和ICG可以透过细胞膜，都呈现出较强的荧光信号，但本发明近红外荧光分子探针的荧光强度相比于ICG提高了25.35％。而在明场图片中(图5b，5d)A549细胞状态与图(5a，5c)是一致的。实验结果证实，本发明近红外荧光分子探针有很好的细胞膜渗透性，在细胞内呈现较强的荧光，能够用于活细胞的近红外荧光成像，有很好的生物应用前景。当前第1页1 2 3