本发明涉及生物领域中的菌体破碎，具体涉及一种应用于蛋白质表达的大肠杆菌的破碎方法。
背景技术：
大肠杆菌是常用的蛋白表达的载体，完成表达后需要将大肠杆菌体破碎方可提取蛋白。对于大肠杆菌破碎而言，传统的大肠杆菌破碎工艺为超声破碎和高压匀浆。超声破碎方法缺点很多，比如由于超声会产生持续的热量，这样会降低蛋白的活性，还破坏蛋白结构，造成蛋白量的损失；且由于超声能把蛋白片段打断，成为不可用的小片段同样造成蛋白损失，因此，超声破碎蛋白的损失率一般均在10-15％左右；此外，超声破碎对体积有要求，体积不能过大，体积过大，超声时间越长，产生的热量也会增加，对蛋白影响会更严重。而高压匀浆仪由于其价格昂贵，且仪器的出故障的概率高，维修费用高，因此，大多数的实验室均不会购买而高压匀浆仪。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的缺陷提供了一种大肠杆菌的破碎方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种大肠杆菌的破碎方法，所述破碎方法包括以下步骤：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液，混匀，静置，则高浓度的蔗糖溶液进入大肠杆菌体内；
②将步骤①中与大肠杆菌混合的蔗糖溶液稀释，混匀，静置，稀释后的蔗糖溶液再次进入浓度较高的大肠杆菌体内，以使菌体内外的浓度一致，在此过程中，菌体破碎或崩破；
③加入饱和硫酸铵溶液，静置；
④离心，弃上清；
⑤将步骤④得到的沉淀溶解，即完成破碎，可进行后续的过程。
进一步地，步骤①中所述的蔗糖溶液的溶度为40％以上，最大浓度为饱和蔗糖溶液，该浓度值为质量和体积的比值；蔗糖溶液的溶度优选为50％，该浓度接近饱和，在该浓度下更有利于大肠杆菌的破碎。
进一步地，步骤①中，所述大肠杆菌与所述蔗糖溶液的比例为：2g:50～100mL。
进一步地，步骤②中，将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液稀释至浓度为15～25％；优选为20％。
进一步地，步骤③中，所述饱和硫酸铵溶液加入至硫酸铵溶液的浓度为30～50％为止，所述的浓度值为质量和体积的比值；优选稀释至硫酸铵溶液的浓度为40％，更利于蛋白的沉淀，几乎不会损失蛋白。
进一步地，步骤①～③中，所述蔗糖溶液中的溶剂为水、PBS或Tris溶液。
进一步地，步骤①～③中，所述静置为在10℃以下静置0.5～2h。
进一步地，步骤④中，所述离心为在12000r/min下离心15min。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明采用蔗糖梯度的方法使大肠杆菌破碎，菌体破碎更彻底，不会损失蛋白，且过程比较简单，方法比较温和，在低温下进行，不会影响蛋白的活性，提取效率比超声破碎高，和高压匀浆提取效率等同，不需要大型的仪器，所用试剂比较便宜，所以成本比较低，适合实验室或生产所用。
综上，本发明的优势明显，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明出现的Tris和PBS均为生物领域常用试剂，Tris的中文名为三羟甲基氨基甲烷；PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液。
实施例1
一种大肠杆菌的破碎方法，该破碎方法包括以下步骤：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液80mL，混匀，4℃的冰箱内静置1h；该蔗糖溶液为饱和的蔗糖水溶液，饱和蔗糖水溶液的浓度约为50％，即将25g的蔗糖溶解于50mL的水中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用水稀释至浓度为20％，混匀，4℃的冰箱内静置1h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵水溶液，加入至硫酸铵水溶液的浓度降为40％，在4℃的冰箱内静置1h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清液；
④收集步骤③中沉淀的蛋白，并在12000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用PBS再溶解，即可进行步骤S5的纯化。
实施例4
一种大肠杆菌的破碎方法，该破碎方法包括以下步骤：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液100mL，混匀，4℃的冰箱内静置1.5h；该蔗糖溶液的溶度为45％的蔗糖溶液，该蔗糖溶液为将22.5g的蔗糖溶解于50mL的PBS溶液中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用PBS稀释至浓度为17％，混匀，4℃的冰箱内静置1.5h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵溶液，加入至硫酸铵溶液的浓度降为35％，在4℃的冰箱内静置1.5h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清液；
④收集步骤③中沉淀的蛋白，在12000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用PBS复溶，即可进行步骤S5的纯化。
实施例5
一种大肠杆菌的破碎方法，该破碎方法包括以下步骤：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液50mL，混匀，4℃的冰箱内静置2h；该蔗糖溶液的溶度为40％的蔗糖溶液，该蔗糖溶液为将20g的蔗糖溶解于50mL的Tris溶液中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用Tris溶液稀释至浓度为15％，混匀，4℃的冰箱内静置2h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵水溶液，加入至硫酸铵水溶液的浓度降为45％，在4℃的冰箱内静置2h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清液；
④收集步骤③中沉淀的蛋白，在15000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用Tris溶液复溶，即可进行步骤S5的纯化。
实施例1～3中均在4℃的低温下静置，主要是因为低温下蛋白更稳定，使用者可以根据实际需要选择温度，但均在本发明的保护范围内。
对比例
采用超声破碎的方法破碎大肠杆菌，则由于超声会产生持续的热量，这样会降低蛋白的活性，还破坏蛋白结构使蛋白质变性，造成蛋白量的损失，且由于超声能把蛋白片段打断，成为不可用的小片段同样造成蛋白损失，因此，造成14.5％的蛋白损失率。
此外，本发明中所提到的硫酸铵溶液和蔗糖溶液的浓度值均为质量与体积比浓度。
具体实施时，大肠杆菌放置于高浓度的蔗糖溶液中，则高浓度的蔗糖溶液进入大肠杆菌体内；将蔗糖溶液稀释后，稀释后的蔗糖溶液再次进入浓度较高的大肠杆菌体内，以使菌体内外的浓度一致，在此过程中，菌体破碎或崩破。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。