水稻大粒基因GS12紧密连锁的分子标记及应用的制作方法

本发明属于水稻高产优质育种和作物分子遗传学领域，具体地说，涉及一种水稻大粒基因GS12紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术：

水稻种子大小不仅是一个重要的产量性状，而且还是一个重要的品质性状。研究其自然变异的分子调控机理可更深入地了解产量和品质的分子基础，为高产、优质水稻新品种培育提供新思路和基因资源。分子遗传学研究表明，水稻种子大的各个子性状均属于复杂的数量性状，受多个数量性状位点的控制。迄今为止，在水稻全基因组上已定位了大量的控制种子大小的基因或数量性状座位(quantitative trait locus，QTL)，但是，已经分离克隆的控制水稻种子大小的基因却只有16个，包括5个粒长基因GS3、TGW6、qGL3/GL3.1/qGL3-1、GS2、GL7，4个粒宽基因GW2、qSW5/GW5、GS6、GW7，1个谷粒充实基因GIF1，和6个调控因子，即：芒和粒长基因An-1、粒宽基因GS5、GW8及调控种子大小的因子OsMKK4、CYP78A13和OsglHAT1(Fan et al.2006；Song et al.2007；Shomura et al.2008；Weng et al.2008；Wang et al.2008；Li et al.2011；Qi et al.2012；Wang et al.2012；Zhang et al.2012；Sun et al.2013；Ishimaru et al.2013；Luo et al.2013；Duan et al.2014；Hu et al.2015；Wang et al.2015)。上述已克隆的影响种子大小的基因(如GS3和qSW5/GW5)多数为普遍存在的遗传变异，大多来自于目前育种的核心材料，继续在育种实践中成功应用的空间十分有限。

利用特殊的遗传材料来定位和分离克隆更多新的控制种子大小的基因，有利于增强对水稻种子大小自然变异的认识，为改良稻米产量和品质提供新的、更多的基因资源。野生稻蕴藏着无数特异优良性状和遗传多样性，是栽培稻育种的宝贵种质资源。通过野生稻与栽培稻的杂交转育，野生稻中的许多有利基因已被转移到栽培稻中，并选育出了一大批水稻新品种。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种水稻大粒基因GS12紧密连锁的分子标记及应用，利用大粒品种和小粒品种配制的F₂分离群体和近等基因系，通过遗传分析，定位第12号染色体上的粒重新基因GS12，获得与之紧密连锁的基于PCR扩增的实用经济型分子标记。该标记可以预测水稻植株是否含有大粒基因GS12，提高大粒高产水稻品种的选择效率。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种水稻大粒基因GS12紧密连锁的分子标记，暂时不写。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)通过本发明鉴定到第12号染色体上的粒重新基因GS12及可以对其进行基因型鉴定的共显性分子标记。

2)与目前报道的影响粒重的基因GS3、TGW6、qGL3/GL3.1/qGL3-1、GS2、GL7，GW2、qSW5/GW5、GS6、GW7，GS5、GW8都不同，本发明GS12是源于小粒野生稻基因渗入系K1561的一个同时控制粒重、粒宽和粒长的新的基因位点。

3)本发明通过新基因标记的筛选，能够获得粒重、粒宽和粒长均增加的高产品种。

4)本发明的分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效的鉴别大力个体，便于及时杂交选育，加快育种进程。

5)本课题组在前期研究中构建了一套小粒野生稻导入系(韦宇，李孝琼，黄克宁，陈颖，高国庆，邓国富，郭嗣斌；小粒野生稻导入系的构建及性状鉴定，南方农业学报，2015年06期)，通过多年的鉴定，从中筛选出一批高产、优质、多抗新材料。其中，一份小粒野生稻基因渗入系K1561，千粒重达34.5g，农艺性状稳定，配合力好，与多个不育系配制的杂交组合均表现粒重显著增加。利用K1561和广西优质小粒恢复系G1025，构建F₂分离群体，并对粒重、粒宽和粒长的QTL进行了初步的遗传定位与分析。结果发现，在第12号染色体上检测了一个主效QTL，其同时控制粒重、粒宽和粒长三个性状，命名为GS12(Grain Size/Shape on Chromosome 12)，该QTL物理位置不同于以往已经克隆的任何主效或微效QTL基因。目前我们已经构建好了GS12的近等基因系，验证了其遗传效应，并已经把GS12精细定位至140kb的区间。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明K1561和G1025及F₂单株的粒形表现；

图2是本发明GS12在染色体上的位置示意图；

图3是本发明标记G96、G87和G111在G1025/K1561的F₃代单株的的扩增产物，其中，K为K1561；G为G1025；M为Marker；1～96为BC₃F₃群体单株代号。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1粒重新基因GS12紧密连锁标记的获得及应用

(一)供试材料及表型鉴定

利用来源于小粒野生稻基因渗入系的大粒品种K1561和广西的优质小粒恢复系G1025杂交(图1)，收获杂种一代自交种子形成288个体的F₂代分离群体。随后进一步用G1025作轮回亲本、F₂群体中目标区段杂合的株系作为供体亲本，并借助分子标记辅助选择，于2013年春季至2014年秋季在南宁连续3次回交和1次自交，得到该区间分离的BC₃F₁近等基因系，并自交得到BC₃F₂及两种近等基因系纯合基因型：NIL(K1561)(大粒)和NIL(G1025)(小粒)。

测定主要用普通的0～150mm量程的游标卡尺和加拿大Regent仪器公司的WinSEEDLE软件和配套扫描仪。分别选取10粒大粒亲本K1561和小粒亲本G1025的谷粒，用游标卡尺测量其粒长和粒宽，重复2次，并取平均值；F₂代及BC₃F₂QTL定位群体，每单株选10粒在WinSEEDLE软件配套扫描仪上直接扫描测其粒长和粒宽。千粒重的测量是每次选取500粒称其重量，重复2次，取平均值，并将其转化成千粒重。

(二)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对个单株分别提取基因组DNA。

PCR扩增体系采用10μL的反应体系，模板DNA 10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR缓冲液1μL，dNTPs 0.2mmol，Taq DNA聚合酶0.25U，用ddH2O补齐至10μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物在6％聚丙烯酰胺变性凝胶和银染显色法进行检测，或采取本领域已知的常规检测技术。

(三)遗传图谱构建和QTL定位分析

利用Mapmaker/Exp 3.0构建F2群体的SSR标记全基因组遗传连锁图谱。用MapDraw V2.1绘制遗传连锁图谱，并用计算机画图软件进行图谱修改。用软件QTLNetwork-2.0对2011年的F₂群体和2015年的BC₃F₂群体的粒重和粒形性状进行QTL定位。

(四)分子标记的获得

从分子生物学数据库网站(http://www.gramene.rg/)和公开文献中获得861对SSR标记，在水稻的12条染色体均匀分布。引物由上海生工生物科技有限公司合成，筛选在双亲间具有多态性的标记用于初步定位。通过BLAST程序在线(http://www.ncbi.nlm.nilh.gov/guide/)比对分析9311和日本晴在目标区间的序列差异，寻找差异SNP位点。用CAPS或dCAPS的方法则可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。引物由上海生工生物科技有限公司合成，筛选在双亲间具有多态性的标记用于精细定位，具体见表1。

表1多态性标记引物对、扩增产物大小及在第12号染色体上的位置

(五)粒重新基因的初步定位

在2012年和2013年对F₂群体的粒形性状进行了鉴定，用QTLNetwork-2.0软件分析检测到一个效应值最大的QTL同时控制粒重、粒宽和粒长等三个性状，命名为GS12(表2)。利用F_2:3后代测验表明目标基因GS12符合单基因的孟德尔因子分离，随后将该基因定位在标记GM103和GM108之间2.1cM的区域内。该QTL物理位置不同于以往已经克隆的任何主效或微效QTL，所以，GS12是一个新的调控水稻种子大小QTL。

(六)粒重新基因的精细定位

利用GS12的近等基因系，并验证了其遗传效应。为了排除其它未知的和可能的微效QTL的影响，我们用G1025作轮回亲本、F₂群体中目标区段杂合的株系作为供体亲本，并借助分子标记辅助选择，于2013年春季至2014年秋季在南宁连续3次回交和1次自交，得到该区间分离的BC₃F₁近等基因系，并自交得到两种近等基因系纯合基因型：NIL(K1561)(大粒)和NIL(G1025)(小粒)。2015年春季在南宁种植了1500株的BC₃F₂随机群体，选用其中的288个单株的随机小群体进行了遗传效应分析，发现千粒重、粒宽和粒长三个性状呈现了共分离，分离比例符合期望的单一的孟德尔因子(表3)。

表2两年在同一区间检测到的三个QTL及其效应

表3近等基因系粒形表现及其随机群体的千粒重、粒宽和粒长的频率分布

利用目标区段7个多态性分子标记构建了GS12局部的遗传图谱，通过288个单株的BC₃F₂随机群体的遗传分析表明，在分子标记GM103和GM108区间检测到了这个同时控制千粒重、粒宽和粒长三个性状的主效QTL，它分别解释千粒重、粒宽和粒长表型变异的51.1、67.3％和33.5％(表4)。两种纯合基因型NIL(K1561)(大粒)和NIL(G1025)(小粒)的粒宽相差约0.44mm，粒长相差约1.65mm，千粒重相差约4.82g，千粒重差异主要来源于粒宽和粒长的差异。

表4近等基因系背景下GS12的遗传效应分析

目前已经将GS12精细定位至140kb的区间。我们利用2015年春季在南宁种植的1500株近等基因系F₂随机群体，用G103和G108分子标记筛选重组单株，获得了16株重组单株，于2015年秋季在南宁种植这16株重组单株的后代，每个重组单株种植30株，进行后代测验，把GS12基因定位在约140kb的G96和G111分子标记之间，与G87分子标记共分离(图2)。

(七)结果与分析

在定位过程中，以标记G96、G87和G111分别筛选了50个杂合单株构建的20000株的BC₃F₃群体，杂合单株单收单种，每个株系均出现了粒形分离，G96和G111筛选的准确率达到了98％，G87筛选的准确率达到了100％(图3)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所

<120> 水稻大粒新基因GS12紧密连锁的分子标记及应用

<130> 2016

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacacctagc acgcaagtac g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttacaaggg aaattcgtac cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctatgtgca cgtccttcat gc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaaaccaga gaagatcagc agagg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgggagacga tcagaaagca 20

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgacgacaag gactgagtgt catttgagaa tgaaaattct 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgattgttc ttctggcccg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgtgaatcca ggtagaatgc a 21

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgacgacaag gactgttaag acttggccag tattttcaga ggta 44

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agggtcctcg gtgaaactta 20

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgacgacaag gactgaaatt aacttactga ttgtacacac gg 42

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgaagagaa aggtgccagt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcaagcagac catcctccta 20

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gacgacaagg actggaaaag tccactgtct tgctgctgga gct 43