本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种产鸟苷(Guanosine)的微生物菌株的选育方法。
背景技术：
鸟嘌呤核苷guanosine，又名鸟苷，其商品名称为GR，又名9-13-D-呋喃核糖基鸟嘌呤。其用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂5'-鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠和核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造三磷酸鸟苷钠等药物的主要原料。选育鸟苷生产菌时，选育了抗鸟嘌呤或鸟嘌呤结构类似物的突变株，发现丧失GMP还原酶的菌株主要积累鸟苷。日本的渡边等将鸟苷生物合成途径中的关键酶PRPP转酰胺酶基因克隆到载体质粒中，然后将该重组质粒导入到枯草芽胞杆菌中，结果鸟苷的产量提高了4倍。三井等采用体外诱变的方法构建出SAMP合成酶缺失株，该工程菌株于34℃发酵70h，其鸟苷产量为19.0g/L。Nogami等人证明GMP还原酶阴性菌的鸟苷产量比阳性菌要高，并发现腺嘌呤或腺苷抑制IMP到GMP途径中酶的活性，据此以枯草芽胞杆菌NO102为出发菌，得到抗腺嘌呤，腺苷突变株NT1017(8-AGr+Ade-+His-+AARs+GMPred-)，可在发酵液中积累5.4g/L鸟苷。Momose等研究发现8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂黄嘌呤都抑制菌体的生长，而这种抑制可以被鸟苷所解除，据此得到的抗这两种嘌呤类似物的突变株能够解除其对GMP合成途径的抑制，从而提高鸟苷的产量。Komatsu等根据同样的原理筛选了腺嘌呤缺陷，抗8-氮杂黄嘌呤，GMP还原酶阴性的突变株，并进一步筛选到核苷水解酶部分缺失的GR2176可积累鸟苷10.3g/L。
技术实现要素：
针对上述理论，本发明要解决的技术问题是为工业化大生产提供一种方便快捷的鸟苷生产菌株的有效筛选方法。高产稳定的
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种鸟苷生产菌株的筛选方法，步骤为：
I.将待筛选的鸟苷生产菌接入含有培养基①的三角瓶中，振荡形成培养液；
II.用接种针取步骤I培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养得出单株；梯度划线分纯即平板划线分纯法，在划线的过程就是菌液稀释的过程；
III.将步骤II单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡形成培养液；
IV.用接种针取步骤III培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出二次分纯单株，所得二次分纯单株扩大培养，利用摇瓶发酵筛选出鸟苷生产菌株。
进一步：在上述鸟苷生产菌株的筛选方法中，步骤I中所述的振荡条件为：35±2℃，转速200±10rpm，振荡培养16～24h；培养基①为葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.5±0.1％、蛋白胨0.2±0.05％、氯化钠0.5±0.05％，余量是水。
步骤II的培养条件为：33±2℃，培养24-48小时；培养基②为葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.1±0.05％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、黄嘌呤0.01±0.005％、8-氮杂鸟嘌呤0.01±0.005％、8-氮杂黄嘌呤0.01±0.005％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
步骤III中所述的振荡条件为：35±2℃，转速200±10rpm，振荡培养16～24h。培养基③为葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.1±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.01％、黄嘌呤0.01±0.002％、8-氮杂鸟嘌呤0.02±0.002％、8-氮杂黄嘌呤0.02±0.001％，余量是水。
步骤IV的培养条件为：33±2℃，培养24-48小时，培养基④为葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.5±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、腺苷0.5±0.01％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
所述步骤IV中二次分纯单株扩大培养是指将二次分纯单株转接到试管斜面中扩大培养的过程。
再进一步：为进一步选出更优良的鸟苷生产菌株，本发明还提供了由上述方法所得鸟苷生产菌株的摇瓶筛种步骤，即将上述鸟苷生产菌株在摇瓶培养，30～40℃，摇床振荡培养24～48h，发酵液离心得上清液，利用纸层析分离杂质，在260nm处测紫外吸收值(A260)，从而得出最优良的几株鸟苷生产菌，所述纸层析的层析液重量比为，异丙醇:氨水:水等于7:2:1。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果是：在鸟苷菌的生产特性与代谢途径基础上，操作与理论相结合，通过结构类似物的压迫作用，让符合高产特性的菌株优先生长，有目的地进行筛选，为高鸟苷菌株的筛选提供了简便、高效的筛选方法。最终得出稳定性好，产苷高的菌株，进行入库保存，供工业大生产使用，保障工业生产鸟苷产量的稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。
实施例
I.将待筛选的鸟苷甘油种液在接入含有培养基①的三角瓶中，振荡培养，温度为35℃，转速200rpm，振荡培养18h，至对数生长期停止培养。
II.在无菌操作台上，用接种针取上述培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养温度33℃，培养40小时，得出单菌落。
III.无菌条件下挑选生长饱满的3个单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡培养，温度35℃，转速200rpm，振荡培养20h。
IV.在无菌操作台上，用接种针各取培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出单株菌落，培养温度33℃，培养24小时，各平板中选择6个生长饱满的单株株扩大培养待用。
再将由上述筛选方法得出的18株鸟苷生产菌株放在摇瓶培养，37℃，摇床振荡培养48h，发酵液离心得上清液，经纸层析(异丙醇:氨水:水＝7:2:1)分离杂质后，用0.01M盐酸溶液浸泡1小时，洗脱出鸟苷后，在260nm处测紫外吸收值(A260)，计算摇瓶发酵液鸟苷含量，结合糖耗分析，得到最优良的鸟苷生产菌株3株，此菌株制成甘油种液或冻干种长期保存。
上述整个工艺流程共计约9-10天。