本申请属于生物医学
技术领域：
，涉及干细胞定向诱导分化领域，具体涉及一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法。
背景技术：
：帕金森病(Parkinson’sdisease，简称PD)是常见于老年人的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔兹海默病，位于第二位。一直是临床治疗的难点。目前认为其主要病因为脑中多巴胺能神经元的退行性变，大脑的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的药物和手术疗法能缓解疾病的早期临床症状，但无法阻止或逆转多巴胺能神经元退行性变，而且长期使用有明显的副作用。干细胞的发现以及体外诱导分化为神经细胞的成功使得细胞移植替代治疗成为可能。干细胞治疗需要合适的种子细胞，并把种子细胞培养获得适合移植使用的目标细胞，即多巴胺能神经元样细胞。目前认为可能用于PD治疗的干细胞来源包括胚胎干细胞(embryonicstemcells，简称ESCs)，神经干细胞(Neuralstemcells，简称NSCs)，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，简称MSCs)等。胚胎干细胞体外向多巴胺能神经元分化已有报道(Buytaert-HoefenKA,AlvarezE,andFreedCR.GenerationoftyrosinehydroxylasepositiveneuronsfromhumanembryonicstemcellsaftercoculturewithcellularsubstratesandexposuretoGDNF.StemCells,2004.22(5):p.669-74.)。但是胚胎干细胞一般是来自于异源性组织的细胞，有免疫排斥的风险，并且伦理学争议较多。神经干细胞，一般是来自于胚脑神经组织得到的，体外也可分化为大脑中几乎所有类型的神经元，包括多巴胺能神经元(LieDC,etal.Theadultsubstantianigracontainsprogenitorcellswithneurogenicpotential.JNeurosci,2002.22(15):p.6639-49.)。但是神经干细胞相比胚胎干细胞分化潜能低，单一谱系方向分化效率也较低，同时来源有限，且有伦理学争议。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外一定条件下可向神经细胞进行分化。并且骨髓间充质干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化、又可进行自体移植等特点，被认为是帕金森病等神经退行性疾病细胞替代疗法的理想来源。目前体外诱导的方法主要分为3种：①神经营养因子和细胞因子，如维甲酸、脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等诱导分化。②化学试剂，二甲基亚砜、2-巯基乙醇、丁羟茴醚等诱导分化。③基因转染或修饰的诱导分化。全骨髓培养得到的MSCs在体外合适条件和诱导因子作用12天可分化为表达多巴胺神经元标记物酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，简称TH)的神经元样细胞，并具有一定的电生理活性，分化效率可达67％，是目前骨髓间充质干细胞能达到的最大分化率以及最短的诱导时间(TrzaskaKA,KuzhikandathilEV,RameshwarP,Specificationofadopaminergicphenotypefromadulthumanmesenchymalstemcells.StemCells,2007.25(11):p.2797-808.)。然而，目前技术难以通过体外诱导分化得到足够数量的成熟多巴胺能神经元，而且移植后的细胞存活数量有限、移植细胞不易与原有神经网络融合都在一定程度上限制了其临床应用。因此，在细胞替代治疗帕金森病，提高骨髓间充质干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的分化效率是解决这些问题的关键。肝X受体(LiverXreceptor，LXR)是核受体家族中重要的一员，有α和β两种亚型，LXRα除在肝脏高表达外，也在脂肪组织、肾、小肠、肺、肾上腺及巨噬细胞表达；LXRβ几乎在所有的组织和器官内表达，尤其在脑。近年研究发现LXR在中枢神经系统中有重要功能，包括参与皮质板层神经元发育、维持运动神经元的存活、调节脂代谢、调节神经免疫以及参与突触可塑性和轴突形成等多种生理功能。LXRα/β基因双敲除小鼠显示脂质在脑内逐渐累积，以及脊髓运动神经元和腹侧中脑多巴胺能神经元的丢失(SacchettiP,etal.LiverXreceptorsandoxysterolspromoteventralmidbrainneurogenesisinvivoandinhumanembryonicstemcells.cellStemCell,2009.5(4):p.409-19.)然而，迄今未见有关LXR激动剂对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元方向分化影响的报道。技术实现要素：有鉴于此，本申请针对上述存在的问题，提供了一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法。为了解决上述技术问题，本申请公开了一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，骨髓间充质干细胞(MSCs)按20000个/ml密度接种，用Neurobasalmedium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH(250ng/ml)，FGF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)联合0.5μMLXR激动剂(T0901317)共同诱导6天。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：1)肝X受体作为靶点参与多巴胺能神经元的诱导分化及其机制。2)肝X受体激动剂联合细胞因子SHH、FGF-8、bFGF可诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向多巴胺能神经元分化，提高了诱导分化率，并缩短了诱导时间，产生协同作用。3)肝X受体激动剂与其他诱导方法(如：化学试剂诱导，基因转染，其他细胞因子等)联用,可能促进诱导干细胞(如：胚胎干细胞、神经干细胞、脐带间充质干细胞等)向多巴胺能神经元的诱导，分化与成熟。当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为倒置相差显微镜观察原代和传代培养后的骨髓间充质干细胞(10×20)；其中(a)：原代培养；(b)：传代培养后细胞呈典型的长梭形，漩涡状生长；图2为流式细胞仪检测克隆化培养后的骨髓间充质干细胞表面标记物的流式图；图3为倒置相差显微镜观察诱导后的骨髓间充质干细胞(10×20)；其中(a)：对照组细胞呈长梭形；(b)：处理组细胞胞体聚拢，并有突起；(c)：LXR组细胞胞体聚拢，并有突起；图4为免疫荧光检测诱导后多巴胺能神经元相关标记物Nestin的表达(×400)；其中(a)：对照组无神经标记物Nestin阳性表达；(b)与(c)：处理组和LXR组均有神经标记物Nestin阳性表达(红色)；图5为免疫荧光检测诱导后多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH的表达(×200)；其中(a)：对照组无多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH阳性表达；(b)与(c)：处理组和LXR组均有多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH阳性表达(红色)；(d)：三组多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH表达量比较；图6为LXR激动剂对MSCs向TH阳性神经元分化方向分化的影响；图7为荧光实时定量PCR检测诱导后相关基因TH、Nurr1、Pitx3的相对表达量。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。一、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和鉴定1、大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养和传代提取SD大鼠股骨和胫骨骨髓，移入20％FBS(v/v)培养基中培养。CO2培养箱(饱和湿度；95％air-5％CO2；37℃)中培养2天后全量换液，PBS洗2-3次去除悬浮未贴壁细胞。每2天换液一次，当细胞汇合度达70％-80％时，0.25％Trypsin-EDTA消化成单细胞悬液，1:2进行传代，改用10％FBS培养基继续培养。原代培养和传代后培养的细胞形态见图1所示。传代培养方法：细胞长至70-80％汇合时传代，用吸管吸去培养瓶内培养液，PBS清洗3次，0.25％Trypsin-EDTA消化至大部分细胞从底壁脱落，加入2ml10％FBS培养基中和胰酶，将细胞移至无菌离心管内，常温下1500转，离心5min，去上清，10％FBS培养基轻柔地将细胞吹打成单细胞悬液，1:2接种至新的无菌培养瓶中，置于CO2培养箱内继续培养。扩增培养基成分如下：成分来源100ml含量DMEM/F-12Hyclone80ml,90mlFBSGibco20ml,10ml2、骨髓间充质干细胞的表面标记物检测用流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞。取第3代大鼠BMSCs对数生长期的细胞，PBS清洗细胞3次，0.25％Trypsin-EDTA消化细胞，培养基终止消化并吹打至获得单细胞悬液。取约106个细胞，按抗体说明书分别加入相应检测量的荧光标记抗体(CD44-PE，CD29-FITC，CD90-PE，CD11b-PE，CD45-FITC)和相应的同型对照抗体，混匀，室温避光放置30min。加入600μlPBS，1000g离心5min，弃上清，加入200μlPBS重悬细胞。流式细胞仪检测。图2为流式细胞仪检测细胞表面标记物结果。可见：第3代大鼠BMSCs表达CD29，CD90，CD44，表达率分别为99.96％，98.47％，99.92％，不表达CD11b，CD45，表达率分别为0.71％，0.90％。二、定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化向多巴胺能神经元向分化1.定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化向多巴胺能神经元向分化将(一)中1步骤后的骨髓间充质干细胞(MSCs)按20000个/ml密度接种，分3组，即对照组、处理组和LXR组。处理组改用Neurobasalmedium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH(250ng/ml)，FGF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)作用12天不换液；LXR组在处理组的基础上联合0.5μMLXR激动剂(T0901317)同时加入并作用6天不换液；对照组不加诱导剂与LXR激动剂，采用10％FBS培养。均置于CO2培养箱(饱和湿度；95％air-5％CO2；37℃)中培养。镜下观察到一些MSCs在诱导剂作用下转变为神经元样形态，对照组细胞形态无明显变化。见图3。2.免疫荧光和定量PCR检测诱导分化后细胞标记物表达。诱导分化后取出细胞爬片，4％多聚甲醛室温固定10min，PBS洗涤5mins*3次；非免疫性动物血清封闭，37℃30mins后PBS洗涤；按照抗体说明书所推荐浓度加入不同一抗(Nestin1:200；TH1:200与Tuj11:200共同孵育)，4℃孵育过夜，37℃复温30mins后PBS洗涤5mins*3次；加入相应种属及推荐浓度荧光标记的二抗(Abbcine)，37℃孵育30mins，PBS洗涤5mins*3次；室温孵育DAIP5-7mins(碧云天)，PBS洗涤5mins*3次；50％甘油封片。分别置于NikonA1+R共聚焦显微镜相应激发光下观察荧光。用NIS-ElementsAR4.2软件计算TH与Tuj1荧光强度。诱导分化率＝TH阳性细胞/Tuj1阳性细胞。经过诱导后，骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞，DAPI衬染细胞核(蓝色),处理组和LXR组神经标记物Nestin均有阳性表达(红色)；对照组则无阳性结果。见图4。经过诱导后，骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞，DAPI衬染细胞核(蓝色),多巴胺能神经元相关标记物Tuj1(绿色)和TH(红色)免疫荧光显示，处理组和LXR组均有Tuj1(绿色)和TH(红色)阳性表达；对照组则无阳性结果。与对照组比较，处理组Tuj1、TH荧光强度均显著升高(**P<0.01)；与处理组比较，LXR组Tuj1、TH荧光强度均显著升高(##P<0.01)。见图5。免疫荧光结果显示，对照组、处理组和LXR组TH染色阳性细胞数平均值分别为14.02％、62.61％和87.42％，与对照组比较，处理组TH染色阳性细胞数显著升高(**P<0.01)；与处理组比较，LXR组TH染色阳性细胞数显著升高(##P<0.01)。见图6。3.定量PCR检测诱导分化后细胞标记物表达q-PCR检测：细胞总RNA的提取：使用TRIzol总RNA抽取试剂盒(日本TaKaRa公司)分别抽取细胞3组后的总RNA，分光光度计测抽提的RNA纯度与浓度，保存于-80℃。cDNA的合成：逆转录体系：根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明将逆转录体系配制如下：A去除gDNA的10ul体系：配好后室温下放置5min。B20ul逆转录体系：冰上进行，反应液配好后轻柔混匀，立即开始逆转录反应，反应条件，37℃，15min；85℃，5sec；4℃冷却。合成的cDNA置于-20℃保存。RT-PCR反应体系：根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明将扩增体系配制扩增条件：95℃30sec+95℃5sec+60℃30-60sec收集荧光(40个循环)所用引物如下表所示：(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)结果的计算方法：采用相对定量ΔΔCt计算3组细胞基因的相对表达量。统计学处理：数据均用表示，设置差异显著水平为双侧α＝0.05。采用软件SPSS17.0做统计学分析，Dunnett’st检验做组间比较。诱导后检测分化细胞中多巴胺能神经元发育相关基因TH、Nurr1、Pitx3的表达。GADPH作为内参。与对照组比较，处理组TH、Nurr1、Pitx3基因相对表达量均显著升高(*P<0.05与**P<0.01)；与处理组比较，LXR组TH、Nurr1、Pitx3基因相对表达量均显著升高(#P<0.05与##P<0.01)。见图7。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。当前第1页1 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