本发明属于磁性材料固定化酶技术领域，具体涉及一种用聚丙烯酰胺包覆磁性纳米颗粒固定化漆酶的方法和应用。
背景技术：
固定化漆酶延长了漆酶的使用寿命，降低了漆酶的使用成本，提高了漆酶的稳定性及其对环境的耐受性，使漆酶在工业废水处理、生物传感器等方面的应用前景更为广阔。
固定化漆酶的使用次数和效率与酶催化反应的生成物有关。当生成物是有色的氧化性物质或者是不溶性物质时，酶的使用次数和效率大大下降。因为漆酶的催化反应过程中常产生一些氧化性的醌类物质，它们的化学性质非常活泼，很容易吸附在载体上，使固定化酶失活。因此，可以通过使用离子强度高的缓冲溶液冲洗载体而使这种现象得到部分消除。而要彻底消除这种现象就必须选择合适的固定化载体。这种载体的表面不会吸附这些有色的氧化性物质，从而可以长期保持固定化漆酶的活性。例如玻璃陶瓷材料虽然对漆酶的固定化效率不高 (只有 50%)，但它对有色的氧化性物质吸附非常低，因此在处理纺织厂和造纸厂的污水时能够较长时间保持活性。
另一方面当催化反应的生成物是不溶性物质时，它会在反应器中沉淀，并且容易在反应器出口过 滤膜处沉积从而导致流速减慢甚至完全堵塞出口。这种现象通常是不可避免的，因为多酚氧化酶在催化反应中会产生自由基和苯醌类化合物，这些物质很容易产生聚合物从而产生絮状沉淀。这个问题可以通过使用固定化酶的同时，用高分子阳离子絮凝剂如壳聚糖等来清除反应产生的聚合物或沉淀而加以解决。
今后，漆酶固定化的发展方向将是扩大固定化 漆酶产品的生产和应用。首先要解决的是真菌大规 模生产游离漆酶的工业化问题；其次是要在固定化漆酶产品的工业化生产条件、设备及最佳工艺流程方面进行更进一步的研究。固定化漆酶技术作为一种高效的生物酶催化技术必将在今后的工业废水处理中产生巨大的应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种聚丙烯酰胺包覆磁性纳米颗粒固定化漆酶的方法和应用。
本发明利用水热法和悬浮聚合法，通过简单的操作就可以制备出用来固定化漆酶的聚丙烯酰胺包覆磁性纳米颗粒。
本发明提供的一种聚丙烯酰胺包覆磁性纳米颗粒固定化漆酶的方法和应用，包含的工艺步骤如下：
（1） 以含铁化合物（如三氯化铁、硫酸铁等）、碱（如乙酸钠、氨水等）、表面活性剂（如聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等）为原料，用水热法制备出四氧化三铁磁性纳米颗粒；
（2）利用油酸改性四氧化三铁磁性纳米颗粒；
（3）以丙烯酰胺为主要原料，以苯乙烯、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈、正庚烷为辅助原料，用悬浮聚合制备出聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒；
（4）以戊二醛为联合剂，将漆酶固定化在聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒上；
（5）用磁性载体固定化的漆酶，可以重复多次回收使用，来降解水中的酚类污染物。
本发明步骤（1）中所述水热法合成四氧化三铁的原料为：含铁化合物（如三氯化铁、硫酸铁等）、碱（如乙酸钠、氨水等）、表面活性剂（如聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等），溶剂为乙二醇、水、二甘醇等或者其混合物，合成温度为60-300℃，合成时间为6-72小时。
本发明步骤（2）中所述油酸改性为：将步骤（1）中合成的四氧化三铁纳米颗粒加入含有油酸的蒸馏水中，反应条件为氨水调节PH=10，反应温度65-85℃，机械搅拌1-3小时。
本发明步骤（3）中所述悬浮聚合的反应溶液为：将步骤（2）中改性后的四氧化三铁纳米颗粒加入含有丙烯酰胺、苯乙烯、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈、正庚烷的水溶液中，冰溶超声15-30分钟，0-4℃静置10-24小时；上述溶液再加入饱和氯化钠和淀粉水溶液，反应温度60-80℃，机械搅拌2-4小时。
本发明步骤（4）中所述固定化漆酶过程为：将步骤（3）中悬浮聚合后制备出的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒加入含有戊二醛的水溶液中，15-30℃机械搅拌5-8小时；再将聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒洗涤干净，加入漆酶溶液中，20-30℃摇摆振荡5-7小时。
本发明步骤（5）中所述的降解水中污染物的过程为：将聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒固定化漆酶加入含有酚类污染物（如双酚A、对乙酰氨基酚等）的水中，15-30℃摇摆振荡2-4小时。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附带权利要求书所限定的范围。
实施例1：
称取1g三氯化铁2.7g乙酸钠0.75g PEG6000，将三种固体完全溶解于30ml 乙二醇中，超声15分钟，搅拌30分钟，得到深黄色的反应混合溶液。将混合溶液装入100ml反应釜，放入马弗炉中反应，反应温度200℃，反应时间8小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.5g上述合成的四氧化三铁纳米加入10ml蒸馏水中，加入0.5g油酸，用氨水调节PH约为10，反应温度80℃，机械搅拌1小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层清液倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是亲油性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.15g上述反应得到的亲油性四氧化三铁纳米颗粒加入50ml蒸馏水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二异丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均匀后，冰溶超声20分钟，4℃静置12小时。在上述溶液中加入30ml饱和氯化钠，加入0.69g淀粉，反应温度70℃，机械搅拌2小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6小时，反应完成后，用水和乙醇交替洗涤，再加入到30ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6小时。固定化结束后，用磁铁吸引分离，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液去除未能结合上去的游离酶。
用Bradford-考马斯亮蓝法，测定载体的载酶量，计算载体的载酶率，载酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可见分光光度法，测定游离态的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，计算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
将固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒0.1g加入含有20mg/L双酚A的水溶液20ml中，室温摇摆振荡2小时，99%以上的双酚A被分解。
实施例2
称取5g三氯化铁13.5g乙酸钠3.75g PEG6000，将三种固体完全溶解于150ml 乙二醇中，超声15分钟，搅拌30分钟，得到深黄色的反应混合溶液。将混合溶液装入250ml反应釜，放入马弗炉中反应，反应温度200℃，反应时间8小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是四氧化三铁纳米颗粒。
称取2.5g上述合成的四氧化三铁纳米加入100ml蒸馏水中，加入2.5g油酸，用氨水调节PH约为10，反应温度80℃，机械搅拌1小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层清液倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是亲油性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.75g上述反应得到的亲油性四氧化三铁纳米颗粒加入250ml蒸馏水中，加入 7.5g丙烯酰胺，加入1.8ml苯乙烯，加入1.9ml二乙烯基苯，加入0.11g偶氮二异丁腈，加入3ml正庚烷，混合均匀后，冰溶超声20分钟，4℃静置12小时。在上述溶液中加入150ml饱和氯化钠，加入3.45g淀粉，反应温度70℃，机械搅拌2小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.5g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒,加入100ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6小时，反应完成后，用水和乙醇交替洗涤，再加入到150ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.1g,然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6小时。固定化结束后，用磁铁吸引分离，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液去除未能结合上去的游离酶。
用Bradford-考马斯亮蓝法，测定载体的载酶量，计算载体的载酶率，载酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可见分光光度法，测定游离态的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，计算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
将固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒0.5g加入含有20mg/L双酚A的水溶液100ml中，室温摇摆振荡2小时，99%以上的双酚A被分解。
对比实施例1，本实施例2是将实施例1中各步骤中反应物量和溶剂量等全部放大了5倍，具体的制备方法和操作方法与实施例1中相同，得到的结果与实施例1基本一致。
实施例3：
称取1g三氯化铁2.7g乙酸钠0.75g PEG6000，将三种固体完全溶解于30ml 乙二醇中，超声15分钟，搅拌30分钟，得到深黄色的反应混合溶液。将混合溶液装入100ml反应釜，放入马弗炉中反应，反应温度180℃，反应时间12小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.5g上述合成的四氧化三铁纳米加入10ml蒸馏水中，加入0.5g油酸，用氨水调节PH约为10，反应温度80℃，机械搅拌1小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层清液倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是亲油性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.15g上述反应得到的亲油性四氧化三铁纳米颗粒加入50ml蒸馏水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二异丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均匀后，冰溶超声20分钟，4℃静置12小时。在上述溶液中加入30ml饱和氯化钠，加入0.69g淀粉，反应温度70℃，机械搅拌2小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6小时，反应完成后，用水和乙醇交替洗涤，再加入到30ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6小时。固定化结束后，用磁铁吸引分离，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液去除未能结合上去的游离酶。
用Bradford-考马斯亮蓝法，测定载体的载酶量，计算载体的载酶率，载酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可见分光光度法，测定游离态的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，计算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
将固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒0.1g加入含有20mg/L双酚A的水溶液20ml中，室温摇摆振荡2小时，99%以上的双酚A被分解。
对比实施例1，本实施例3是将实施例1中水热法制备四氧化三铁磁性纳米颗粒的反应温度改为180度，反应时间改为12小时，具体的制备方法和操作方法与实施例1中相同，得到的结果与实施例1基本一致。
实施例4：
称取1g三氯化铁2.7g乙酸钠0.75g PEG6000，将三种固体完全溶解于30ml 乙二醇中，超声15分钟，搅拌30分钟，得到深黄色的反应混合溶液。将混合溶液装入100ml反应釜，放入马弗炉中反应，反应温度200℃，反应时间8小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.5g上述合成的四氧化三铁纳米加入10ml蒸馏水中，加入0.5g油酸，用氨水调节PH约为10，反应温度80℃，机械搅拌1小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层清液倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是亲油性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.15g上述反应得到的亲油性四氧化三铁纳米颗粒加入50ml蒸馏水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二异丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均匀后，冰溶超声20分钟，4℃静置12小时。在上述溶液中加入30ml饱和氯化钠，加入0.69g淀粉，反应温度80℃，机械搅拌3小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6小时，反应完成后，用水和乙醇交替洗涤，再加入到30ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6小时。固定化结束后，用磁铁吸引分离，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液去除未能结合上去的游离酶。
用Bradford-考马斯亮蓝法，测定载体的载酶量，计算载体的载酶率，载酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可见分光光度法，测定游离态的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，计算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
将固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒0.1g加入含有20mg/L双酚A的水溶液20ml中，室温摇摆振荡2小时，99%以上的双酚A被分解。
对比实施例1，本实施例4是将实施例1中用悬浮聚合制备聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒过程中的反应温度改为80℃，机械搅拌时间改为3小时，具体的制备方法和操作方法与实施例1中相同，得到的结果与实施例1基本一致。
实施例5：
称取1g三氯化铁2.7g乙酸钠0.75g PEG6000，将三种固体完全溶解于30ml 乙二醇中，超声15分钟，搅拌30分钟，得到深黄色的反应混合溶液。将混合溶液装入100ml反应釜，放入马弗炉中反应，反应温度200℃，反应时间8小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.5g上述合成的四氧化三铁纳米加入10ml蒸馏水中，加入0.5g油酸，用氨水调节PH约为10，反应温度80℃，机械搅拌1小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层清液倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色粉末，即是亲油性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.15g上述反应得到的亲油性四氧化三铁纳米颗粒加入50ml蒸馏水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二异丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均匀后，冰溶超声20分钟，4℃静置12小时。在上述溶液中加入30ml饱和氯化钠，加入0.69g淀粉，反应温度70℃，机械搅拌2小时。反应完成后，自然降温至室温，用磁铁吸引将上层液体倒出，固体用水和乙醇交替洗涤，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒。
称取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三铁纳米颗粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6小时，反应完成后，用水和乙醇交替洗涤，再加入到30ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6小时。固定化结束后，用磁铁吸引分离，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液去除未能结合上去的游离酶。
用Bradford-考马斯亮蓝法，测定载体的载酶量，计算载体的载酶率，载酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可见分光光度法，测定游离态的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，计算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
将固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒0.1g加入含有20mg/L双酚A的水溶液20ml中，室温摇摆振荡2小时，99%以上的双酚A被分解。
回收固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒，重复回收用于降解实验5次，每处理一次污染物后都对回收的固定化漆酶进行彻底的洗涤，仍然能使99%以上的双酚A被分解。
对比实施例1，本实施例5是将实施例1中降解酚类污染物的过程重复回收进行5次，具体的制备方法和操作方法与实施例1中相同，得到的结果与实施例1基本一致。