一种荧光定量PCR反应液及方法与流程

1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：其成分为：10～50mM pH值8.0～8.9的Tris-HCl，10～60mM的KCl，2～5mM的MgCl₂，100～300μM的dNTP，0.025～0.1U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX，5～10％的基础荧光稳定剂，1～3％的DNA聚合酶增强剂，10～30％的DNA聚合酶增强剂的保护剂；

所述DNA聚合酶为普通耐热DNA聚合酶，具有5'-3'聚合酶活性和/或5'-3'外切酶活性；

所述基础荧光稳定剂选自NP-40、TritonX-100、NaCl、KCl中的一种或多种组合；

所述DNA聚合酶增强剂选自牛血清蛋白、二甲亚砜、甲酰胺、亚精胺、环糊精、甜菜碱中的一种或多种组合；

所述DNA聚合酶增强剂的保护剂选自明胶、透明质酸、二硫苏糖醇中的一种或多种组合。

2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述基础荧光稳定剂中，所述NP-40和/或TritonX-100在所述基础荧光稳定剂中的体积百分比为16.7％～33.3％，所述NaCl和/或KCl的摩尔浓度为10～25mM；

所述DNA聚合酶增强剂中，所述牛血清蛋白在所述DNA聚合酶增强剂中的质量体积比为0.5％～1％，所述亚精胺和或环糊精的摩尔浓度为50～150mM，所述甜菜碱和或甲酰胺和/或二甲亚砜的摩尔浓度为1.5～2.5M；

所述DNA聚合酶增强剂的保护剂中，所述明胶和/或透明质酸在所述DNA聚合酶增强剂的保护剂中的质量体积比为1.2％～3.6％，所述二硫苏糖醇的摩尔浓度为0.01～0.05mM。

3.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述荧光定量PCR反应液还包括用于PCR反应的引物、模板、探针、水；

所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物与所述下游引物摩尔比为1:1，浓度为8～12μM；

所述探针为Taqman-MGB探针。

4.根据权利要求3所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述引物的浓度为10μM。

5.根据权利要求1～4任一项所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述一种荧光定量PCR反应液的成分及各成分的份数为：10mM pH值8.5的Tris-HCl，50mM的KCl，4mM的MgCl₂，200μM的dNTP，0.05U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX dye II，6％的基础荧光稳定剂，2％的DNA聚合酶增强剂，20％的DNA聚合酶增强剂的保护剂。

6.根据权利要求1～4任一项所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述DNA聚合酶为具有较高的5'-3'外切酶活性的DNA聚合酶。

7.根据权利要求6所述的一种荧光定量PCR反应液，其特征在于：所述DNA聚合酶为Takara EX Taq^TM HS酶。

8.一种荧光定量PCR反应液的应用方法，其特征在于：基于权利要求1～7任一项所述的一种荧光定量PCR反应液；具体步骤如下：

(1)模板的制备：通过磁珠血浆/血清游离DNA/RNA提取试剂盒从混合血浆中提取血浆游离RNA，并进行逆转录，合成得到混合血浆逆转录的cDNA；

(2)反应液的制备：

按照权利要求1～7任一项所述的一种荧光定量PCR反应液进行反应液制备；

(3)反应：

步骤(2)制备的反应液在荧光定量PCR仪中进行反应，模板选用步骤(1)制备的混合血浆逆转录的cDNA，PCR扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火34秒，共40个循环。

9.一种适用于Taqman-MGB探针的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：基于权利要求1～7任一项所述的一种荧光定量PCR反应液。