一种高产ε‑聚‑L‑赖氨酸高产菌株的复合诱变方法与流程

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种高产ε-聚-L-赖氨酸高产菌株的复合诱变方法。

背景技术：

ε-聚-L-赖氨酸是一种含有25-30个残基的赖氨酸同聚物，它易溶于水，但是不溶于乙酸乙酯，乙醇，乙醚等有机溶剂；其热稳定性高，120℃加热仍具有抑菌活性。ε-聚L-赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，被认为是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂。因其具有广谱抑菌性，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等都有强烈的抑制作用，且抑菌作用明显强于α-聚赖氨酸，并具有安全性能高、水溶性好、热稳定性 好等优点，被广泛应用于快餐、奶油、鲜肉、肠类、禽类等食品保鲜，并被多个国家批准作为食品防腐剂使用，ε-聚L-赖氨酸已于 2003 年10月被FDA批准为安全的天然生物防腐剂，而在我国，ε-聚L-赖氨酸已批准进入《食品添加剂使用卫生标准》。随着我国医药、可生物降解高分子材料、食品安全的进一步强化，安全营养、天然高效的生物食品添加剂将逐步取代化学物添加剂，因此，该产品在各个领域有着巨大的潜在市场。

微生物与酿造工业、食品工业及生物制品工业等的关系非常密切，其菌种的优良与否直接关系到多种工业化产品的好坏，微生物菌种的自然突变率很低，单纯依赖自然突变选育好的菌株远不能满足人们的需求，所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。ε-聚L-赖氨酸产生菌株为灰色链霉菌为主，由于ε-聚L-赖氨酸野生菌合成ε-聚L-赖氨酸的能力均不强，因此，如何提高ε-聚L-赖氨酸产生菌合成能力、选育高产菌株，提高其发酵水平，是实现ε-聚L-赖氨酸工业化生产的必要前提。

技术实现要素：

本申请的发明目的主要是针对以上技术问题，提供一种高产ε-聚-L-赖氨酸高产菌株的复合诱变方法。该方法中对菌株进行复合诱变，增大了遗传物质的损伤程度，产生种类多样的错配位点，经稳定遗传进而形成突变多样库，提高正突变率，易于筛选获得遗传性状稳定性好、产率高的菌株。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：

一种高产ε-聚-L-赖氨酸高产菌株的复合诱变方法，该方法包括以下步骤：

首先以钴60射线进行诱变

1.1以产ε-聚-L-赖氨酸灰色链霉菌为出发菌株，挑取一环接种在新鲜斜面培养基上，恒温培养箱30.5℃，培养120h，进行活化和复壮；

1.2.培养好孢子丰富的新鲜斜面，选取四支，进行钴60射线照射，累计辐射量分别为4万rad、6万rad、8万rad、10万rad；

1.3.对照射后的四个菌株斜面，再分别挑取一环放入装有20mL蒸馏水、少量玻璃珠，经过灭菌的三角瓶中，震荡20-30min，制备菌悬液；

1.4.制备好的菌悬液采用稀释分离法，稀释五个梯度浓度，分别为10^-1-10^-5，在不同浓度的吸取0.1mL进行涂板，于30.5℃恒温培养；

1.5.培养过程中，观察平板上菌落生长情况，培养6-7天；

1.6.在培养好的平板上，挑取单菌落，进行摇瓶，转速220rpm、温度30.5℃、10L发酵罐培养筛选；

1.7.以原始菌株为对照，采用甲基橙法测定ε-聚-L-赖氨酸产量，对钴60诱变后的菌株进行筛选；

1.8.对筛选后的高产菌株进行传递稳定性试验。

对钴60诱变后的菌株进行筛选的步骤为：通过钴60射线不同辐射量的照射，以致死率、分离纯化稀释倍数、单菌落长势情况、显色.抗性平板上透明圈大小为筛选依据，初步筛选，再累计辐射量在8万rad时，致死率在90-95%，稀释浓度10^-4-10^-5 涂板，选取菌落个体大、显色、抗性平板上透明圈明显较大的单菌落进行摇瓶、10L发酵罐培养进行筛选，最终获得一株产量达到12g/L的高产菌株，比原始菌株（产量9g/L）提高33%以上，进行传代稳定性试验，菌株传代稳定好。

高产ε-聚-L-赖氨酸高产菌株的复合诱变方法，该方法还包括常温室压等离子体诱变步骤：

在经过钴60诱变筛选的高产菌株的基础上，再采用ARTP方法，进一步筛选高产ε-聚-L-赖氨酸。

2.1对经过钴60射线筛选出的高产菌株进行活化，转接新鲜斜面进行培养，恒温30℃、培养120h。

2.2 挑取新鲜斜面上的孢子制备菌悬液（孢子浓度在10⁵-10⁷cells/mL），移液枪吸取10μL，均匀涂布到经过无菌处理的载物片上(铁片）。

2.3采用ARTP仪器进行照射，照射时间分别为120min、150min、180min、210min。照射完之后将载物片放入1mL无菌水的EP管中，进行震荡、洗脱。

2.4经过洗脱后，对洗脱液进行稀释，浓度在10^-4-10^-5 涂板（普通、显色.抗性平板），恒温培养6-7天（30℃）。

2.5在培养好的平板上，挑取单菌落，进行摇瓶（转速220rpm、温度30.5℃）、10L发酵罐培养筛选。

2.6以经过钴60筛选获得菌株为对照，采用甲基橙法测定ε-聚-L-赖氨酸产量，对ARTP诱变后的菌株进行筛选。

通过ARTP诱变方法，照射不同的时间（120min、150min、180min、210min），以致死率、单菌落长势情况、显色.抗性平板上透明圈大小为筛选依据，进行初筛。在照射时间在210min，致死率在90%以上，选取菌落个体大、显色.抗性平板上透明圈明显较大的单菌落进行摇瓶、10L发酵罐培养进行筛选，最终获得一株产量达到17g/L的高产菌株，比经过钴60筛选获得菌株（产量12g/L），提,42%以上，进行传代稳定性试验，菌株传代稳定好。

本发明的积极效果体现在：

（一）、采用钴60射线诱变方法，获得一株产量达到12g/L的高产菌株，比原始菌株（产量9g/L）提高33%以上，进行传代稳定性试验，菌株传代稳定好。

（二）、在经过钴60诱变筛选的高产菌株的基础上，再采用ARTP方法，进一步筛选高产ε-聚-L-赖氨酸。最终获得一株产量达到17g/L的高产菌株，比经过钴60筛选获得菌株（产量12g/L），提高42%以上，进行传代稳定性试验，菌株传代稳定好。

（三）、产ε-聚-L-赖氨酸灰色链霉菌原始菌株采用复合诱变方法（钴60射线+ARTP方法），增大了遗传物质的损伤程度，产生种类多样的错配位点，经稳定遗传进而形成突变多样库，提高正突变率，同时其操作方法简便、成本低，根据实验需要，可以随时调整参数（辐射量、时间）进行菌株诱变选育，增大了获得遗传稳定性好、目的产物产量高菌株的几率。

附图说明：

图1为实施例1中菌种经过钴60诱变后，传代培养5代的实验图。

图2为实施例2中菌种经过钴60和ARTP复合诱变后的菌种进行传代培养后的实验图，其中，①为传代培养5代；②为传代培养6代。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1：

以钴60射线进行诱变

1.1以市售的产ε-聚-L-赖氨酸灰色链霉菌为出发菌株，挑取一环接种在新鲜斜面培养基上，恒温培养箱30.5℃，培养120h，进行活化和复壮；

1.2.培养好孢子丰富的新鲜斜面，选取四支，进行钴60射线照射，累计辐射量分别为4万rad、6万rad、8万rad、10万rad；

1.3.对照射后的四个菌株斜面（辐射量不同），分别挑取一环放入装有20mL蒸馏水、玻璃珠（直径4mm,25颗），经过灭菌的三角瓶中，震荡30min，制备菌悬液。

1.4.制备好的菌悬液采用稀释分离法，稀释五个梯度浓度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），不同浓度吸取0.1mL进行涂板，30.5℃恒温培养。

1.5.培养过程中，观察平板上菌落生长情况，培养6-7天。

1.6.在培养好的平板上，挑取单菌落，进行摇瓶，转速220rpm/min、温度30.5℃培养96h，测定ε-聚-L-赖氨酸产量。

1.7.在摇瓶基础上，进行10L发酵罐进一步筛选。

1.8.以原始菌株为对照，采用甲基橙法测定ε-聚-L-赖氨酸产量，对钴60诱变后的菌株进行筛选（摇瓶+10L发酵罐）。

1.9.对筛选后的高产菌株进行传递稳定性试验(用斜面培养基，对筛选出的菌株进行传代培养，每三个月传代一次，传五代，10L发酵罐培养测定ε-聚-L-赖氨酸产量）。

通过钴60射线不同辐射量的照射，以致死率、分离纯化稀释倍数、单菌落长势情况、显色.抗性平板上透明圈大小为筛选依据，初步筛选。在累计辐射量在8万rad时，致死率在90-95%，稀释浓度10^-4、10^-5 涂板，选取菌落个体大、显色.抗性平板上透明圈明显较大的单菌落进行摇瓶、10L发酵罐培养进行筛选，最终获得一株产量达到12g/L的高产菌株，比原始菌株（产量9g/L）提高33%以上。进行菌种传代稳定性试验，菌株每三个月传代一次，传五代，分别对传代过后的斜面菌株进行培养，通过测定ε-聚-L-赖氨酸含量，其产率依然维持在11.5-12g/L,证明经过诱变筛选后的菌种遗传稳定性好。

将经过钴60诱变后的菌种进行传代培养，进一步测定其稳定性和产孢子能力，具体测试结果见图1，经过钴60诱变后，传代培养5代，菌种稳定性好，产孢子能力强。

实施例2：

首先以钴60射线进行诱变

1.1以市售的产ε-聚-L-赖氨酸灰色链霉菌为出发菌株，挑取一环接种在新鲜斜面培养基上，恒温培养箱30.5℃，培养120h，进行活化和复壮；

1.2.培养好孢子丰富的新鲜斜面，选取四支，进行钴60射线照射，累计辐射量分别为4万rad、6万rad、8万rad、10万rad；

1.3.对照射后的四个菌株斜面（辐射量不同），分别挑取一环放入装有20mL蒸馏水、玻璃珠（直径4mm,25颗），经过灭菌的三角瓶中，震荡30min，制备菌悬液。

1.4.制备好的菌悬液采用稀释分离法，稀释五个梯度浓度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），不同浓度吸取0.1mL进行涂板，30.5℃恒温培养。

1.5.培养过程中，观察平板上菌落生长情况，培养6-7天。

1.6.在培养好的平板上，挑取单菌落，进行摇瓶，转速220rpm/min、温度30.5℃培养96h，测定ε-聚-L-赖氨酸产量。

1.7.在摇瓶基础上，进行10L发酵罐进一步筛选。

1.8.以原始菌株为对照，采用甲基橙法测定ε-聚-L-赖氨酸产量，对钴60诱变后的菌株进行筛选（摇瓶+10L发酵罐）。

1.9.对筛选后的高产菌株进行传递稳定性试验(用斜面培养基，对筛选出的菌株进行传代培养，每三个月传代一次，传五代，10L发酵罐培养测定ε-聚-L-赖氨酸产量）。

通过钴60射线不同辐射量的照射，以致死率、分离纯化稀释倍数、单菌落长势情况、显色.抗性平板上透明圈大小为筛选依据，初步筛选。在累计辐射量在8万rad时，致死率在90-95%，稀释浓度10^-4、10^-5 涂板，选取菌落个体大、显色.抗性平板上透明圈明显较大的单菌落进行摇瓶、10L发酵罐培养进行筛选，最终获得一株产量达到12g/L的高产菌株，比原始菌株（产量9g/L）提高33%以上。进行菌种传代稳定性试验，菌株每三个月传代一次，传五代，分别对传代过后的斜面菌株进行培养，通过测定ε-聚-L-赖氨酸含量，其产率依然维持在11.5-12g/L,证明经过诱变筛选后的菌种遗传稳定性好。

在经过钴60诱变筛选的高产菌株的基础上，再采用ARTP方法，进一步筛选高产ε-聚-L-赖氨酸。

2.1对经过钴60射线筛选出的高产菌株进行活化，转接新鲜斜面进行培养，恒温30℃、培养120h。

2.2 挑取新鲜斜面上的孢子制备菌悬液（孢子浓度在10⁵、10⁶、10⁷cells/mL），移液枪吸取10μL，均匀涂布到经过无菌处理的载物片上(铁片）。

2.3采用ARTP仪器进行照射，照射时间分别为120min、150min、180min、210min。照射完之后将载物片放入1mL无菌水的EP管中，进行震荡（2min）、洗脱。

2.4经过洗脱后，对洗脱液进行稀释，浓度在10^-4、10^-5 涂板（普通、显色.抗性平板），恒温培养6-7天（30℃）。

2.5.在培养好的平板上，挑取单菌落，进行摇瓶，转速220rpm/min、温度30.5℃培养96h，测定ε-聚-L-赖氨酸产量。

2.6.在摇瓶基础上，进行10L发酵罐进一步筛选。

2.7以经过钴60筛选获得菌株为对照，采用甲基橙法测定ε-聚-L-赖氨酸产量，对ARTP诱变后的菌株进行筛选。

2.8.对筛选后的高产菌株进行传递稳定性试验(用斜面培养基，对筛选出的菌株进行传代培养，每三个月传代一次，传五代，10L发酵罐培养测定ε-聚-L-赖氨酸产量）。

通过ARTP诱变方法，照射不同的时间（120min、150min、180min、210min），以致死率、单菌落长势情况、显色.抗性平板上透明圈大小为筛选依据，进行初筛。在照射时间在210min，致死率在90%以上，选取菌落个体大、显色.抗性平板上透明圈明显较大的单菌落进行摇瓶、10L发酵罐培养进行筛选，最终获得一株产量达到17g/L的高产菌株，比经过钴60筛选获得菌株（产量12g/L），提,42%以上。进行菌种传代稳定性试验，菌株每三个月传代一次，传五代，分别对传代过后的斜面菌株，进行10L发酵罐培养，通过测定ε-聚-L-赖氨酸含量，其产率依然维持在16-17g/L,证明经过复合诱变筛选后的菌种遗传稳定性好。

将经过钴60和ARTP复合诱变后的菌种进行传代培养，进一步测定其稳定性和产孢子能力，具体测试结果见图2，注：①经过钴60和ARTP复合诱变后，传代培养（5代），菌种稳定性好，产孢子能力强，产量稳定。②经过钴60和ARTP复合诱变后，传代培养（6代），菌种稳定性好，产孢子能力强，产量稳定。

实施例3：

当采用市售的产ε-聚-L-赖氨酸灰色链霉菌直接进行ARTP诱变时发现，采用ARTP单一方法进行诱变，菌株产量在12g左右，继续使用该方法，产量没有进一步提高，同时频繁采用ARTP单一方法进行诱变，因其辐射能量级高，传三代过后，菌株产孢子能力下降，影响菌种的性能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。