本发明涉及细胞领域，特别涉及培养基及山竹细胞次生代谢物的制备方法。
背景技术：
：山竹又称山竹子、莽吉柿、凤果，是藤黄科(Guttiferae)藤黄属(Garcinia)常绿乔木山竹的果实。近年来山竹的药理作用成为研究热点。山竹果壳含有多种氧杂蒽酮衍生物，主要包括α-倒捻子素、γ-倒捻子素等。这些氧杂蒽酮表现出多种生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化及对多种细菌具有抗菌活性。在生物化学上氧杂蒽酮被认为是唯一的自然界找到的由三环芳香族被各种酚类、甲氧基类和异戊二烯所取代，从而产生一系列衍生物的家族。目前，研究人员已经鉴定和分离大约200种氧杂蒽酮，其中40种是在莽吉柿果实中发现的。许多重要的氧杂蒽酮如α－倒捻子酮、β－倒捻子酮、γ－倒捻子酮。目前山竹的氧杂蒽酮类化合物均用化学提取法或复合酶解法。主要存在如下问题：1.化学合成方法工艺复杂。2.安全性低，生产过程中使用大量有机溶剂，极易残留在成品中。3.受限于山竹的生长季节，影响成品的产量。4.细胞大量培养具有浓缩有效物的功效。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种培养基及山竹细胞次生代谢物总氧杂蒽酮类化合物的制备方法。本发明利用山竹细胞培养物中的次生代谢物(山竹细胞培养过程中合成并释放至培养液中具生物活性物质的总称)含有总氧杂蒽酮类化合物，将其次生代谢物收集进行冻干保存。利用总氧杂蒽酮类化合物具抗氧化功效，达到抗衰老的目的，可将该冻干粉运用到化妆品中。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种培养基，包括2,4-D、6-BA和基础培养基；所述2,4-D在所述培养基中的浓度为0.2～2.0mg/L；所述6-BA在所述培养基中的浓度为0.5～3.0mg/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基还包括葡萄糖。在本发明的一些具体实施方案中，所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为1.0～5.0g/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述基础培养基为MS培养基。本发明还提供了所述培养基在培养山竹细胞制备次生代谢物中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述山竹细胞次生代谢物为总氧杂蒽酮类化合物。本发明还提供了一种山竹细胞次生代谢物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得山竹细胞；步骤2：取步骤1获得的山竹细胞与本发明提供的培养基混合后初步培养，再与本发明提供的培养基混合后扩大培养，收集培养液。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述山竹细胞的制备方法为取山竹果皮与基础培养基、纤维素酶和果胶酶混合后酶解，过滤，收集滤液。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述纤维素酶的加入量为所述山竹果皮质量的0.01～0.10％，所述果胶酶的加入量为所述山竹果皮质量的0.01～0.10％。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述纤维素酶的酶活为30000U/mg，所述果胶酶的酶活为50000U/mg。在本发明的一些具体实施方案中，纤维素酶和果胶酶的体积比1:1。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解的时间为3小时。在本发明的一些具体实施方案中，所述初步培养的条件为：取山竹细胞加入I号灭菌培养基将山竹细胞株配制成1-5×105/ml密度的山竹细胞液，取100ml山竹细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培养14天。I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.2～1.0mg/L6-BA1.5～3.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素。在本发明的一些具体实施方案中，所述扩大培养的条件为：经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将山竹细胞配制成1-3x106/ml密度的山竹细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，130-140rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.01-0.05m3/s，培养14天。Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0～2.0mg/L6-BA0.5～1.5mg/L葡萄糖1.0～5.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2收集培养液之后，还包括过滤、浓缩，收集浓缩液后除菌，冻干的步骤。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干为于-20～-35℃，真空度为50～200Pa的条件下，冻干24～36小时。本发明还提供了所述制备方法制得的山竹细胞次生代谢物。在本发明的一些具体实施方案中，所述山竹细胞次生代谢物为总氧杂蒽酮类化合物。本发明还提供了所述山竹细胞次生代谢物在制备抗脂质过氧化的药物、食品和/或化妆品中的应用。本发明还提供了所述山竹细胞次生代谢物在制备抗衰老的药物、食品和/或化妆品中的应用。本发明提供了一种培养基，包括2,4-D、6-BA和基础培养基。通过该培养基以及本发明提供的方法制得的山竹细胞培养物中的次生代谢物(山竹细胞培养过程中合成并释放至培养液中具生物活性物质的总称)含有总氧杂蒽酮类化合物，将其次生代谢物收集进行冻干保存。利用总氧杂蒽酮类化合物具抗氧化功效，达到抗衰老的目的，可将该冻干粉运用到化妆品中。具体实施方式本发明公开了一种培养基及山竹细胞次生代谢物的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了一种山竹细胞次生代谢物的制备方法，包括如下步骤：获取山竹细胞株：取1kg新鲜山竹进行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的山竹果皮，用灭菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。将山竹果皮碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，0.01-0.10％纤维素酶和0.01-0.10％果胶酶，消化3小时。优选的，纤维素酶和果胶酶体积比为1:1。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得山竹细胞株。山竹细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将山竹细胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹细胞液，取100ml山竹细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将山竹细胞配制成1-3×106/ml密度的山竹细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，130-140rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.01-0.05m3/s，培养14天。I号培养基的配方(1LMS培养基中)：名称含量名称含量2,4-D0.2-1.0mg/L6-BA1.5-3.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)：名称含量名称含量2,4-D1.0-2.0mg/L6-BA0.5-1.5mg/L葡萄糖1.0-5.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素山竹细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集山竹细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa，冻干时间为24～36小时，即得到山竹细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。本发明采用植物细胞培养法提取山竹中的总氧杂蒽酮类化合物对提取出的总氧杂蒽酮类化合物进行冻干处理，易于保存和应用，增大稳定性。有益效果包括：1.提取工艺稳定，有效成分浓度大，并能保存其活性。2.安全性高，不残留有机溶剂。3.不受限于山竹的生长季节影响。本发明提供的培养基及山竹细胞次生代谢物的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1获取山竹细胞株：取1kg新鲜山竹进行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的山竹果皮，用灭菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。将山竹果皮碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，0.01％纤维素酶和0.05％果胶酶，消化3小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得山竹细胞株。山竹细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将山竹细胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹细胞液，取100ml山竹细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将山竹细胞配制成1-3×106/ml密度的山竹细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，130-140rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.01-0.05m3/s，培养14天。表1I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.2mg/L6-BA3.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表2Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L葡萄糖3.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素山竹细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集山竹细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-28℃，真空度为50Pa，冻干时间为30小时，即得到山竹细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例2获取山竹细胞株：取1kg新鲜山竹进行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的山竹果皮，用灭菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。将山竹果皮碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，0.10％纤维素酶和0.01％果胶酶，消化3小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得山竹细胞株。山竹细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将山竹细胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹细胞液，取100ml山竹细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将山竹细胞配制成1-3×106/ml密度的山竹细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，130-140rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.01-0.05m3/s，培养14天。表3I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表4Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.5mg/L6-BA1.0mg/L葡萄糖1.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素山竹细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集山竹细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时，即得到山竹细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例3获取山竹细胞株：取1kg新鲜山竹进行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的山竹果皮，用灭菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。将山竹果皮碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，0.05％纤维素酶和0.10％果胶酶，消化3小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得山竹细胞株。山竹细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将山竹细胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹细胞液，取100ml山竹细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将山竹细胞配制成1-3×106/ml密度的山竹细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，130-140rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.01-0.05m3/s，培养14天。表5I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.6mg/L6-BA2.2mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表6Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D2.0mg/L6-BA0.5mg/L葡萄糖5.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素山竹细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集山竹细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-20℃，真空度为120Pa，冻干时间为24小时，即得到山竹细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例4次生代谢物冻干粉中总氧杂蒽酮类含量的测定标准曲线的制备：精密量取α－倒捻子素对照品溶液0，5，10，15，20，25，30μl，总氧杂蒽酮类浓度分别为0，10，15，20，25，30μg/ml，分别置于10ml具塞试管中，加甲醇至1.0ml，摇匀，以甲醇为空白。分别加0.25ml5％亚硝酸钠溶液，摇匀，室温放置9min。再加入0.35ml10％硝酸铝溶液，摇匀，室温放置6min。再加入3.0ml4％氢氧化钠溶液，加甲醇补足体积至5ml，摇匀，室温放置15min，370nm波长处测定吸光度，以α－倒捻子素的量对吸光度作标准曲线。总氧杂蒽酮的提取及测定：样品组1～样品组3：采用实施例1～实施例3制备的冻干粉溶解成液体。取样品粉末0.25g，精密称定，置于具塞试管中，加入5ml柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液和一定质量分数的酶，在一定温度和pH下水浴一定时间，过滤，弃去酶液，再向药渣中加入液固比为1∶17(g/ml)的90％乙醇，超声提取74min后，过滤，并转移至10ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，同时显色，测定吸光度。结果见表7。表7组别总氧杂蒽酮类含量(μg/ml)样品组1(实施例1制备)31.2样品组2(实施例2制备)30.7样品组3(实施例3制备)30.4结论：本专利的植物细胞培养方法能成功提取出丰富的总氧杂蒽酮类物质，且不同批次间的含量无明显差别(P<0.05)，证明方法稳定。实施例5山竹次生代谢物冻干粉对大白鼠皮肤组织匀浆中MDA生成量的影响自由基形成后，其代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增高，MDA为极活泼的交联剂，它能使真皮结构发生大分子交联，使真皮纤维扭曲增粗紊乱，使人的皮肤在外观上日见衰老，MDA含量的高低可间接表征物质的抗脂质过氧化(即抗MDA生成)活性，MDA含量越小，表明物质的抗脂质过氧化能力越强；反之，则抗脂质过氧化能力越弱。将40只大白鼠分成4组，每组10只，去其背部被毛，暴露面积约6cm。，取同一批次的实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉，涂抹前将与其配对的2ml溶酶完全倒入冻干粉中，充分混匀，将2ml混合物全部均匀地涂抹至小鼠暴露的背部，每两天涂抹一次。第一组，连续涂抹实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉5次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第二组，连续涂抹实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉10次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第三组，连续涂抹实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉15次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第四组不涂抹实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉，30天后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。标准管取0.2ml10mol/ml标准品、标准空白管取0.2ml无水乙醇、测定管取0.2ml测试样品，然后三管均加入0.2ml试剂一，混匀后，均加入3ml试剂二和1ml试剂三。旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟。取上清，532mm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测各管吸光度值。结果见表8。表8注：*表明与对照组之间数据有显著差异(P<0.05)结论：证明本专利提取的总氧杂蒽酮类具有明显抗氧化作用(P<0.05)，随着使用天数的增加，效果有明显提升。取实施例2、实施例3制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉进行上述实验，实验结果与实施例1制备的山竹细胞次生代谢物冻干粉的实验结果相近，与其无显著差异(P＞0.05)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3