兔抗人ERK8多克隆抗体的制备方法与流程

本发明属于生命科学技术领域，具体地说是一种兔抗人ERK8多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

ERK8是MAPKs(mitogen-activated protein kinases)——丝裂原活化蛋白激酶家族的最新发现成员。MAPK信号通路是广泛存在于各种动物细胞中的一条信号转导途径，该信号通路对细胞周期的运行及基因的表达调控起着十分重要的作用。MAPK信号通路的核心分子MAPK是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，能被细胞因子、神经递质、细胞应激等激活，同时能磷酸化下游效应分子，包括多种蛋白激酶，磷脂酶及转录因子等，从而引起一系列酶促级联反应来完成一定的生理活动。ERK8是利用大鼠ERK7cDNA从人多组织cDNA文库中钓取的，其编码基因位于8q24.3。ERK8与MAPK家族中的ERK1、ERK2、ERK5和ERK7类似，具有一个可被磷酸化的TEY活性基序。ERK8主要在肾和肺组织中表达。它的活性能被血清、多种DNA损伤因子及致癌因子RET/PTC3，RET/MEN2B和bcr/abl等激活，同时ERK8本身作为激酶能够调节多种核内受体的活性。另外，研究发现ERK8能够激活原癌基因c-Jun并参与结肠癌细胞的转化过程。

抗体，也叫免疫球蛋白(Ig)，是一种能特异性结合抗原的糖蛋白。对生命科学研究来说，抗体是一种非常强大并且不可取代的重要工具。然而，最近的一些研究调查表明，大概一半左右的常用商业化抗体都不能有效地识别它们的目标蛋白。使用这些质量参差不齐的抗体不仅浪费掉科学家大量的金钱与时间，而且影响到许多科学研究的真实性。我们购买了两种来自不同公司的ERK8抗体，其特异性和有效性都不是很好，并且不能有效地识别内源性的ERK8。因此，制备一种特异性好、纯度高的ERK8抗体显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与外源及內源的ERK8蛋白发生特异性结合反应的兔抗人ERK8多克隆抗体的制备方法。

本发明的具体实施步骤如下：

(1).经Immuneepitope(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)工具分析，将ERK8蛋白第446-473位的28个氨基酸作为兔抗人ERK8多克隆抗体表位，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如ID NO：2所示；

(2).经过PCR克隆，PGEX-5X-1-GST-ERK8(28aa)质粒的构建，最终在大肠杆菌BL21细胞中诱导表达GST-ERK8(28aa)蛋白，并将蛋白纯化。

(3).将纯化后的蛋白通过浓缩，脱盐和乳化，乳化后的蛋白在新西兰白兔背部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔10～14天。

(4).最后采用耳静脉注射一次，注射7～10天后，收集、分离得到含有兔抗人EKK8多克隆抗体的血清。

(5).将GSH琼脂糖珠与GST蛋白溶液孵育，使GST蛋白结合到琼脂糖珠上，生成GST-GSH琼脂糖珠。后将GST-GSH琼脂糖珠与血清孵育，使抗GST的抗体与抗ERK8的抗体分离。得到兔抗人ERK8多克隆抗体。

(6).ELISA检测血清中兔抗人EKK8多克隆抗体的效价，所述的兔抗人EKK8多克隆抗体，其效价在1:51200以上。

本发明通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化。本发明制备抗体的方法简单，制备的抗ERK8多克隆抗体具有特异性好、纯度高的特点，可与内源性及外源性ERK8蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫荧光等实验的要求。本发明制备的兔抗人ERK8多克隆抗体可用于组织或者细胞中ERK8蛋白水平的检测，为深入研究人ERK8蛋白的生物学功能和在细胞水平调控机制提供便利，为进一步有可能运用于临床检测奠定基础，具有重要的理论意义和生产价值。

附图说明

图1是人ERK8蛋白氨基酸序列的抗原免疫性分析。X轴代表ERK8的蛋白序列，Y轴代表免疫原性，Y轴数字越高代表一段肽段越有可能在动物体引起强免疫反应。

图2是GST-ERK8(28aa)融合蛋白的表达及纯化电泳图。图中显示，经纯化后获得了纯度较高的GST-ERK8(28aa)蛋白。

图3是纯化的ERK8抗血清的Western Blotting结果图。验证了纯化的血清中去除了抗GST免疫球蛋白。

图4是用ELISA检测抗血清的效价。结果显示该兔抗人EKK8多克隆抗体的效价在1:51200以上。

图5为检测ERK8抗体对在HeLa细胞中表达的不同浓度的內源及外源ERK8蛋白的效价的Western Blotting结果图。

图6为检测ERK8抗体对不同细胞系中內源ERK8蛋白表达的Western Blotting结果图。

图7为ERK8抗血清与公司所售抗体的效果比较图。

图8是用ERK8抗血清通过免疫荧光实验检测ERK8抗血清特异性的结果图。

图9是用封闭肽抑制抗体与抗原结合的Western Blotting结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明所涉及兔抗人ERK8多克隆抗体的制备方法作进一步说明。(下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。)

步骤一，抗原序列的确立

人ERK8蛋白序列的B细胞抗原决定簇利用Immuneepitope(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)工具分析得到，如图1所示,X轴代表ERK8的蛋白序列，Y轴代表免疫原性。Y轴数字越高代表一段肽段越有可能在动物体内引起强免疫反应。将ERK8蛋白第446-473位的28个氨基酸作为兔抗人ERK8多克隆抗体表位，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如ID NO：2所示；

步骤二，重组质粒PGEX-5X-1-GST-ERK8(28aa)的构建

根据pGEX-5X-1的多克隆位点和选取的ERK8抗体表位的DNA序列设计引物：

上游引物：5'-CGGATCCTTATGCCAAGCGGGAGGGGAGCT-3'；

下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTACCAGTCACCCCGGAT-3'。

以pGEX-2T-ERK8(provided by Dr.M.K.Abe)为模板，通过PCR扩增得到目的片段，PCR反应条件为：95℃，3min；95℃，30sec，70℃，30sec，72℃，30sec，25个循环；72℃，7min；目的片段经BamH I(TaKaRa),Not I(TaKaRa)双酶切后做胶回收，以T4DNA Ligase连接酶(TaKaRa)连接入经BamH I、Not I双酶切的pGEX-5X-l质粒，连接反应条件为：22℃，2h；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，使用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养箱过夜培养；挑取单菌落接种到3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃恒温摇床培养14h，提取质粒并测序。

步骤三，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并诱导表达抗原

选择步骤二中测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，使用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养箱过夜培养；挑取单菌落接种到3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃恒温摇床培养12h后，以1:100的比例从中取出1mL菌液接种到100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃恒温摇床上生长2h后，每隔大概15min测量一次OD600值。当OD600值达到0.6到0.8之间的时候，加入0.1M的IPTG诱导剂至终浓度为0.1mM。继续在37℃恒温摇床上生长5h后，将菌液收集到50mL的离心管里，离心12,000×rpm，4℃，30min。离心完毕后，倒掉上清，菌体在-80℃冰箱冻存30min以上。菌体用6mL预冷的PBS溶液重悬，于冰上超声30min以上，每次超声45sec停止30sec,至菌液变清亮。4℃离心30min，12,000×rpm，收集上清转移到15mL离心管。

步骤四，纯化诱导表达的抗原

使用GE Healthcare公司的Glutathione secepharose 4B beads，取100μL加到步骤三收集到的上清中，封口膜封口，4℃下用垂直混合仪摇过夜,12-18r/min。4℃，500×g离心5min，吸走上清,避免吸到沉淀。在管中加入预冷的10mL PBS溶液，来回颠倒30sec，将beads洗涤一次，4℃，500×g离心3min，弃上清,反复5次以上。最后一次将beads用适量预冷的PBS转移到1.5mL离心管中，4℃，500×g离心3min,弃上清，再离心5min,以小枪头吸净珠子表面水膜，尽量吸净但不吸走beads，即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose beads。向Sepharose中加入100μL洗脱液A(10mM Glutathione in 50mM Tris-HCl，pH 8.0)，冰上放置1h。4℃，1,000×rpm离心5min，转移上清到一支新的1.5mL离心管中。向Sepharose中再加入100μl洗脱液B(40mM Glutathione in 50mM Tris-HCl，pH 8.0)，冰上放置1h。4℃，1,000×rpm离心5min，转移上清到一支新的1.5mL离心管中。

如图2所示，1为marker，2为未用IPTG诱导的菌体裂解后的蛋白上清，3为用IPTG诱导后的菌体裂解后的蛋白上清，4为纯化后的诱导蛋白。由图2可知，在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG诱导表达得到了GST-ERK8(28aa)融合蛋白，经纯化后获得纯度较高的GST-ERK8(28aa)蛋白。

步骤五，抗原的浓缩和脱盐

将纯化好的GST融合蛋白加入到Amicon-Ultra-4超滤管中，离心5,000×g，4℃，5min。离心后，倒掉流出的溶液。加入3.5mL预冷的1×PBS，再次离心5min，倒掉流出的溶液。重复以上步骤5次。最后一次离心后，小心取出超滤管中所有的溶液，即为浓缩和脱盐后的抗原溶液。

步骤六，抗原与福氏佐剂的乳化

将等体积的弗式佐剂缓慢地加入到抗原溶液内，涡旋混匀。用超声破碎仪将混合液破碎5sec，放置于冰上30sec。重复以上步骤10次左右，直至取出一滴混合液滴到冷水中，1min内不会扩散为止。

步骤七，用纯化的抗原蛋白对家兔进行免疫

首次使用与等体积弗式完全佐剂乳化后的抗原蛋白1mg，在10周龄的新西兰白兔背部皮下多点注射。之后每隔两星期皮下注射与等体积弗式不完全佐剂乳化后的抗原蛋白0.5mg，共两次。两周之后，从兔子耳静脉注射0.5mg抗原蛋白。

步骤八，心脏取血及血清分离

末次免疫后两周之内对兔子进行心脏取血。取血后，将盛放血的离心管保持垂直状态于室温放置约1h，待完全凝固后，再放入4℃冰箱。8h后取出离心，3,000×rpm，4℃，10min。离心后收集上层稻黄色的通明液体，该液体即为血清。

步骤九，去除血清中抗GST的免疫球蛋白

将pGEX-5X-1-GST质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中诱导表达GST蛋白。诱导条件为37℃，5h,0.1mM IPTG。收集菌体超声裂解，将清亮的上清加入100μL Glutathione secepharose 4B beads，4℃下用垂直混合仪摇过夜。第二天用预冷的PBS洗beads 5次以上。离心之后即获得GST-GSH beads。取2mL血清与GST-GSH琼脂糖珠在4℃下用垂直混合仪孵育过夜，第二天4℃，500×g离心3min，此时抗GST的抗体已经结合在琼脂糖珠上，使得抗ERK8的抗体与抗GST的抗体分离开来。如图3所示，未纯化的血清对GST蛋白有很强的免疫反应性，而纯化后的ERK8抗血清，对GST不再有免疫反应性，只对ERK8有很强的免疫反应性。

步骤十，ELISA检测抗血清的效价

用ELISA实验检测纯化后ERK8抗血清的效价，如图4，左侧X轴代表纯化后血清的稀释倍数，Y轴代表在450nm处的吸光度值，实线与虚线分别表示ERK8抗血清与阴性对照血清的效价曲线。右侧表示纯化后的抗血清与阴性对照在450nm处的吸光度比值。由图可知，当稀释倍数为51,200时，纯化后的ERK8抗血清与阴性对照的比值为2.49，大于2.1，表明纯化后ERK8抗血清的效价为1:51,200。

本实施例所得抗体是用人ERK8靠近C端一段蛋白作为抗原得到的，该抗体具有免疫印迹、细胞染色等用途，不仅可以用于ERK8蛋白的体内检测，还可以用于ERK8蛋白的体外检测。

实施效果

(I)Western Blotting

图5，图6及图7是用Western Blotting检测本实施例制备的多克隆抗体的特异性和灵敏度。

图5中，在HeLa细胞中转染了空载体pcDNA3.1及融合质粒pcDNA3.1-ERK8，收集细胞裂解液，取不同上样量用ERK8抗血清做Western Blotting。结果显示，ERK8抗血清能同时检测到內源及外源ERK8蛋白。图6是用ERK8抗血清检测不同细胞系中內源ERK8蛋白表达情况，显示了ERK8在多个细胞系中都有表达。图7为ERK8抗血清与公司所售抗体的效果比较，由图可知，本实施例制备的多克隆抗体的与公司购买的抗体相比，有更高的特异性和灵敏度。并且，公司购买的抗体大多不能够有效地检测到细胞內源的ERK8蛋白，而本实施例制备的多克隆抗体能够检测到。

(2)免疫荧光

图8通过免疫荧光在细胞水平上检测ERK8抗血清的有效性和特异性。

在转染了pcDNA4-Xpress-ERK8的HeLa细胞中进行免疫荧光实验,如图8所示，Xpress检测到的信号(红色)与ERK8抗血清检测到的信号(绿色)在细胞中表现出很强的一致性(黄色),表明我们制作的抗血清也能有效的检测到自然状态下的ERK8蛋白。

(3)封闭肽实验

图9通过ERK8封闭肽孵育ERK8抗血清，使抗体与抗原的结合被阻止。使用未封闭及封闭的ERK8抗血清分别检测转染了ERK8的293T细胞。结果显示，未封闭的ERK8抗血清能够明显的检测到ERK8蛋白，而当抗体被封闭后，抗体不能与抗原结合，从而无法检测到ERK8蛋白信号。这进一步证实了我们制备的ERK8抗血清是有效的。

以上内容显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 汕头大学医学院

<120> 兔抗人ERK8多克隆抗体的制备方法

<160>2

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 1

ccaagcggga ggggagctgc gccctccctg acctcccagg ctgcggctca ggtggccaac 60

caggccctga tccggggtga ctgg 84

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 2

Pro Ser Gly Arg Gly Ala Ala Pro Ser Leu Thr Ser Gln Ala Ala

1 5 10 15

Ala Gln Val Ala Asn Gln Ala Leu Ile Arg Gly Asp Trp

20 25 28