本发明涉及水产食品加工技术领域，具体地涉及一种具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。
血管紧张素转化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)为肾素-血管紧张素系统的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素I，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素II，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ACE的活性对降低血压有着积极的作用，因而开发有效的ACE抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。
现有技术中有利用海水鱼资源或蛤类制备ACE抑制肽的方法，也有报道采用罗非鱼鱼皮为原料生产ACE抑制肽，这些方法均不同程度存在脱腥、脱色、脱苦等工序，无疑增加了工艺繁琐程度和生产成本，不利于产业化生产。目前国内外专利中未见利用淡水鱼肉资源制备血管紧张素转化酶抑制肽的专利文献报道，我国淡水鱼类资源丰富，若能提供一种无须脱味工序，且利用淡水鱼肉制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，将能够大大降低生产成本，提供优质的具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽，用于特需食品和营养食品的制备。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述鱼肉蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述鱼肉蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽制备方法，包括以下步骤:
(1)制备去脂的鱼肉浆液；
(2)调节鱼肉浆液温度和pH值为1-3，加入胃蛋白酶酶解；
(3)调节步骤(2)的酶解液温度和pH值为6.5-8.0，加复合蛋白酶酶解；
(4)酶解液高温下保温后冷却至室温，离心并取上清液通过二步超滤法处理；
(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。
步骤(1)首先将鱼肉高温处理，再打浆，加入水制得鱼肉浆液，离心去上层脂肪得到去脂的鱼肉浆液。所加入的水是符合饮用水卫生标准的清洁水。
所述高温处理可以为110-121℃，20-40min。
本发明对鱼肉进行高温处理，可以明显改善鱼肉蛋白的结构，提高鱼肉蛋白对酶的敏感性。在本发明的一个实施例中，是将新鲜鱼肉经过110-121℃高温处理20-40分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入1.0-3.0倍鱼肉重量的水，通过8000-10000rpm分散均质机匀浆1～3min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心10-15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。
步骤(2)调节鱼肉浆液的温度为40-45℃，调节pH值为1.8-2.5，按照胃蛋白酶为鱼肉质量的0.2％-0.4％加入胃蛋白酶，酶解15～120min。调节pH值可选用食品领域可用的NaOH或HCl来调节，例如用1mol/L的NaOH或HCl来调节pH值。
本发明提供的上述方法中，步骤(3)调节步骤(2)的酶解液的温度为50-60℃，调节pH值为7.0-7.5，按照复合蛋白酶为鱼肉质量的0.2％-0.4％加入复合蛋白酶，酶解30～90min。
其中，步骤(3)所述的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，二者质量比为1-2：1。
上述方法中，步骤(4)的高温下保温是指在95-100℃下保温3-5min，冷却至室温；离心条件为4000-6000g离心5-10min。
步骤(4)的二步超滤法为先用孔径大于6000D的膜超滤，取分子量小于6000D的蛋白多肽，再用孔径为2000D的膜超滤，得到分子量小于2000D的蛋白肽。
上述制备方法的步骤(5)中，将分子量小于2000D的蛋白肽滤液经过Sephadex G-25的凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰,再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为5mL/min，取10-13分收集的肽溶液，即得具有ACE抑制功能的肽溶液。
上述方法还包括将步骤(5)得到的ACE抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉ACE抑制粉。其氨基酸序列为Lys-Thr-Pro-Pro-Gly-Ile–Pro、Tyr-Asn-Arg-Leu-Pro-Glu和Phe-Asn-His-His-Met-Phe的肽的含量为40％-50％。
上述制备方法制备得到的鱼肉蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的鱼肉蛋白肽具有优异的ACE抑制功能。
进而，本发明提供了该鱼肉蛋白肽在制备降血压药物中的应用。含有本发明方法制得的鱼肉蛋白肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：(1)本发明选用来源丰富的淡水鱼类为原料，原料易得，成本低，易操作；(2)本发明对鱼肉进行高温处理，可以明显改善鱼肉蛋白的结构，提高鱼肉蛋白对酶的敏感性；(3)本发明采用多种食品级复合蛋白酶(胃蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶)，在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量的鱼肉蛋白肽，不加任何添加剂，为100％鱼肉蛋白肽，安全无污染可食用；(4)本发明方法制得的鱼肉蛋白肽IC 50值为小于0.34mg/mL，具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制的功能，能广泛应用于特需食品和营养食品。(5)本发明开发鱼肉蛋白肽中具有明确的特定功能的肽(Lys-Thr-Pro-Pro-Gly-Ile–Pro、Tyr-Asn-Arg-Leu-Pro-Glu和Phe-Asn-His-His-Met-Phe)的组成成分，肽中分子量小于1000的肽的比例为95％以上，易于机体消化和吸收。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用草鱼鱼肉10克，经过121℃高温处理30分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入2.0倍鱼肉重量的水，通过10000rpm分散均质机匀浆3min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl来调节步骤(1)鱼肉浆液的pH为2.0，温度调节为45℃，然后按照胃蛋白酶为鱼肉质量的0.3％加入胃蛋白酶，酶解60分钟。
(3)用1mol/L的NaOH或HCl来调节调节步骤(2)的酶解液的pH为7.0，温度调节为55℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：菠萝蛋白酶＝1～2:1)为鱼肉质量的0.3％加入复合蛋白酶，酶解90分钟。
(4)将步骤(3)的酶解液，在95℃下保温3～5min，冷却至室温，在4000g条件下离心10min，收集上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于6000道尔顿的蛋白多肽，再利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于2000道尔顿的蛋白多肽液。
(6)将步骤(5)所得的多肽液，经过Sephadex G-25的凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰,再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5％～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为5mL/min，取10-13分收集的肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉ACE抑制肽粉。其主要肽的氨基酸序列分别为Lys-Thr-Pro-Pro-Gly-Ile–Pro、Tyr-Asn-Arg-Leu-Pro-Glu和Phe-Asn-His-His-Met-Phe，三种肽的含量达到41％以上。
实施例2具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用鳙鱼肉100克，经过115℃高温处理40分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入3.0倍鱼肉重量的水，通过8000rpm分散均质机匀浆3min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl来调节调节步骤(1)鱼肉浆液的pH为2.5，温度调节为45℃，然后按照胃蛋白酶为鱼肉质量的0.3％加入胃蛋白酶，酶解60分钟。
(3)用1mol/L的NaOH或HCl来调节步骤(2)的酶解液的pH为7.5，温度调节为50℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：菠萝蛋白酶＝1～2:1)为鱼肉质量的0.2％加入复合蛋白酶，酶解60分钟。
(4)将步骤(3)的酶解液，然后在95℃下保温5min，冷却至室温，在5000g条件下离心10min，收集上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于6000道尔顿的蛋白多肽，利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于2000道尔顿的蛋白多肽液。
(6)将步骤(5)所得的多肽液，经过Sephadex G-25的凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5％～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为5mL/min，取10-13分收集的肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的ACE抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉ACE抑制粉。其主要肽的氨基酸序列分别为Lys-Thr-Pro-Pro-Gly-Ile–Pro、Tyr-Asn-Arg-Leu-Pro-Glu和Phe-Asn-His-His-Met-Phe，三种肽的含量达到41％以上。。
实施例3具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用鳙鱼肉1000克，经过121℃高温处理20分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入1.0倍鱼肉重量的水，通过10000rpm分散均质机匀浆2min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl来调节步骤(1)鱼肉浆液的pH为2.0，温度调节为45℃，然后按照胃蛋白酶为鱼肉质量的0.4％加入胃蛋白酶，酶解30分钟。
(3)用1mol/L的NaOH或HCl来调节调节步骤(2)的酶解液的pH为7.5，温度调节为60℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：菠萝蛋白酶＝1～2:1)为鱼肉质量的0.2％加入复合蛋白酶，酶解90分钟。
(4)将步骤(3)的酶解液，然后在95℃下保温5min，冷却至室温，在6000g条件下离心5min，收集上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于6000道尔顿的蛋白多肽，利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于2000道尔顿的蛋白多肽液。
(6)将步骤(5)所得的多肽液，经过Sephadex G-25的凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取10-13分收集的肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的ACE抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉ACE抑制粉。其主要肽的氨基酸序列分别为Lys-Thr-Pro-Pro-Gly-Ile–Pro、Tyr-Asn-Arg-Leu-Pro-Glu和Phe-Asn-His-His-Met-Phe，三种肽的含量达到41％以上。
实施例4鱼肉蛋白肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉蛋白肽及合成的肽的ACE抑制能力按照如下方法进行：
ACE抑制率的方法。用高效液相色谱可以在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
1、试剂的配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
2、ACE抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速:1mL/min；流动相A:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量:10μL，手动进样；
3、测定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100,
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
4、半抑制浓度的测定
按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。结果见表1。
5、鱼肉蛋白肽中分子量分布的测定：参照GB/T22729-2008方法测定。
由表1可知，本发明制备的鱼肉蛋白肽具有很好的ACE抑制活性，其IC50值小于0.34mg/mL，其鱼肉蛋白肽中分子量小于1000的达到95％以上。
表1鱼蛋白肽的ACE抑制活性实验结果
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种具有ACE抑制功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法
<130> KHP161116971.3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 1
Lys Thr Pro Pro Gly Ile Pro
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 2
Tyr Asn Arg Leu Pro Glu
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 3
Phe Asn His His Met Phe
1 5