一种Lewis血型抗原检测方法与流程

本发明属生物学和医学检验领域，涉及一种lewis血型抗原检测方法。更具体而言，涉及通过一步测序法测定lewis血型抗原的基因型，并通过基因型确定lewis抗原的表型的方法，本方法能提高检测的敏感性和准确性。

背景技术：

现有技术公开了lewis血型抗原的合成和表达是在前体糖链基础上通过多个糖基转移酶连续作用形成的。研究报道，与红细胞有关的lewis血型抗原主要有le^a和le^b，两个同源基因fut2和fut3共同决定4种lewis表型，其中fut3基因决定lewis抗原的表达与否，而fut2基因决定lewis抗原的表达的表达量。研究还表明了在i型前体糖链基础上，通过fut2酶(存在于分泌型个体中)作用形成h糖链，进一步通过fut3酶形成le^b抗原和红细胞le(a-b+)表型；当fut2酶失活(非分泌型个体)无法形成分泌型h糖链时，fut3酶直接作用于i型前体糖链形成le^a抗原和红细胞le(a+b-)表型；当fut2酶部分失活(弱分泌型个体)时，则同时形成le^a、le^b抗原和红细胞le(a+b+)表型；当fut3基因变异导致功能性的fut3酶缺陷时，无论个体是否具有功能性的fut2，其前体糖链均无法进一步形成le^a或le^b抗原，表现为红细胞le(a-b-)表型。

鉴于临床已有若干关于lewis血型抗原不符引起的输血相关性溶血反应的报道，而且，尤其，lewis血型抗原的相关基因fut2和fut3多肽性与多种疾病的疾病易感性有密切联系，包括幽门螺旋杆菌感染、溃疡性结肠炎、胃癌、肠癌及多种感染性疾病，更为重要的是，lewis血型抗原系统决定了ca19-9的表达与分泌，lewis抗原阴性(约占人群的5-10％)无法分泌ca19-9，而ca19-9是目前胰腺癌中重要的、应用广泛的标记物的现状，因此，lewis抗原血型检测具有重要的临床意义。

目前检测lewis血型抗原的方法主要为通过抗原凝集反应，其中使用的标本多为血液。由于机体内组织包括消化道粘膜等合成lewis抗原后分泌至组织间隙中，包括血液、消化液等，红细胞吸附lewis抗原至其表面；由于红细胞自身无法合成与分泌lewis抗原，导致通过血液、消化液的lewis抗原的检测存在较多假阳性和假阴性，如国际著名的肿瘤学期刊《临床肿瘤学杂志》(《journalofclinicaloncology》)报道lewis抗原阴性的胰腺癌患者高达30％。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的lewis血型抗原检测方法。具体涉及通过基因测序方法测定lewis抗原相关基因的基因型，通过基因型确定lewis抗原的表型得方法。

技术实现要素：

本发明的目地是为克服现有技术的抗原凝集反应检测lewis血型抗原方法的不足，提供一种新的lewis血型抗原检测方法。尤其涉及通过一步测序法测定lewis血型抗原的基因型，并通过基因型确定lewis抗原的表型的方法，本方法能提高检测的敏感性和准确性。

本发明通过基因测序方法测定lewis抗原相关基因的基因型，通过基因型确定lewis抗原的表型。

具体的，本发明的lewis血型抗原检测方法，其特征在于，其包括步骤：

1)设计检测lewis血型抗原的多重pcr反应引物，以及设定特定的pcr反应条件，将所有位点通过一个pcr反应完成；

2)通过第一代测序方法检测lewis相关基因fut2和fut3的基因型，并通过基因型确定lewis抗原表型。

本发明方法中，多重pcr反应的引物序列下式所示：

本发明方法中，使用商业化的dna提取试剂盒提取基因组dna；使用微型离心机或真空处理从全血或淋巴细胞中提取总基因组dna。

本发明方法中，pcr扩增的位点包括fut3：59，202，314位点(358f/r)，508，1067位点(p1f/p1r)，以及fut2：357，385，428，571，739位点(fut21f/2r)；pcr反应条件：1:94℃5min；2:94℃30s；3:tm62℃30s；4:72℃30s(tostep238cycles)；5:72℃10min。

本发明方法中，pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳：控制电压保持在110v，电流在40ma以上；用dnamarker标记产物大小。

本发明方法中，片段完全分离后，在紫外灯下切取所需条带，dna在紫外灯下爆光时间不超过30s。

本发明方法中，将胶回收产物加入测序仪，通过一代测序sanger测序法检测序列。

本发明方法中，对测序图进行基因型分析，采用chromas软件打开测序图，分析各个位点的情况；将获得基因型整合分析。

本发明方法中，通过基因型确定表型。

本发明中，fut3阴性的基因型包括纯合突变：t202c或c314t或g508a或t1067a；杂合突变：t59g/g508a合并t202c/c314t；t59g/t1067a合并t202c/c314t,t59g合并t202c/c314t,t59g/g508a/t1067a合并t202c/c314t；以及t59g纯合突变合并杂合：t202c或c314t或g508a或t1067a。

本发明中，fut2阴性包括除fut3阴性的所有的fut2纯合突变。

本发明中，fut2阳性，fut3阳性：le(a-b+)表型；fut2阴性，fut3阳性：le(a+b-)表型；fut2杂合，fut3阳性：le(a+b+)表型；fut3阴性le(a-b-)表型。

本发明的lewis血型抗原检测方法，通过一步测序法测定lewis血型抗原的基因型，并通过基因型确定lewis抗原的表型的方法，本方法能提高检测的敏感性和准确性，有宜于对lewis血型抗原的相关基因fut2和fut3多肽性与多种疾病的疾病易感性的评估及判断，具有重要的临床意义。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1是dna提取流程，其中，使用微型离心机或真空处理从全血或淋巴细胞中提取总基因组dna。

图2是设计的多重pcr反应的引物序列，其中的pcr反应条件：1:94℃5min；2:94℃30s；3:tm62℃30s；4:72℃30s(tostep238cycles)；5:72℃10min。

图3是琼脂糖凝胶电泳后的pcr反应产物，其中包括，配置1％的琼脂糖凝胶，加入混有tbe缓冲液的pcr产物，加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在110v，电流在40ma以上，使用dnamarker标记产物大小。

图4是胶回收示意图，显示片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，dna在紫外灯下爆光时间不超过30s。

图5是sanger测序仪，显示将胶回收的产物加入测序中，通过一代测序sanger测序法检测序列。

图6是fut359位点测序例图，其中显示采用chromas软件打开测序图，分析各个位点的情况；图中的测序图基因型分别为：gt、tt、gg。

具体实施方式

实施例1测定lewis血型抗原的基因型，并确定lewis抗原的表型

1)提取基因组dna，

使用商业化的dna提取试剂盒，使用微型离心机或真空处理从全血或淋巴细胞中提取总基因组dna；

本方法中，处理过程包括裂解、结合、洗涤、洗脱、测定dna浓度等；可处理带有edta、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全血样本，样品量可达200μl，操作时间为20–40分钟，可从200μl健康全血中获得4–12μgdna，洗脱体积在50–200μl范围；

2)pcr反应：pcr扩增的位点包括fut3：59，202，314位点(358f/r)，508，1067位点(p1f/p1r)，以及fut2：357，385，428，571，739位点(fut21f/2r)；dna样品浓度为10ng/ul-100ng/ul,od260/280(1.6-2.0)，50ul体系加样：toptaqbuffer:5ul；dntps:4ul；primerr/f:2ul/2ul；dna:2ul；toptaqdnapolymerase:1ul；pcr反应条件为：1:94℃5min；2:94℃30s；3:tm62℃30s；4:72℃30s(tostep238cycles)；5:72℃10min；

3)pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳：配置1％的琼脂糖凝胶，加入混有tbe缓冲液的pcr产物，加样后，合上电泳槽盖，立即接通电源；控制电压在110v，电流40ma以上；用dnamarker标记产物大小；

4)胶回收：片段完全分离后，紫外灯下迅速切取所需条带，dna在紫外灯下爆光时间不超过30s；称取凝胶块的重量，按每1g凝胶加入1mlbindingbuffer对应量，加入适量体积的bindingbuffer，55-60℃水浴至凝胶完全溶解(约7-10min)，每隔2-3min振荡一次；

5)测序检测：将胶回收的产物加入商业化的测序仪中，通过一代测序sanger测序法检测序列；

6)对测序图进行基因型分析：本实施例采用fut359位点测序图为例图；采用chromas软件打开测序图，分析各个位点的情况；例图中的测序图基因型分别为：gt、tt、gg；将获得基因型整合分析：fut3阴性的基因型包括纯合突变：t202c或c314t或g508a或t1067a，杂合突变；t59g/g508a合并t202c/c314t；t59g/t1067a合并t202c/c314t,t59g合并t202c/c314t,t59g/g508a/t1067a合并t202c/c314t以及t59g纯合突变合并杂合:t202c或c314t或g508a或t1067a；fut2阴性包括除fut3阴性的所有的fut2纯合突变；

6)通过基因型确定表型：在i型前体糖链基础上，通过fut2酶(存在于分泌型个体中)作用形成h糖链，进一步通过fut3酶形成le^b抗原和红细胞le(a-b+)表型；当fut2酶失活(非分泌型个体)无法形成分泌型h糖链时，fut3酶直接作用于i型前体糖链形成le^a抗原和红细胞le(a+b-)表型；当fut2酶部分失活(弱分泌型个体)时，则同时形成le^a、le^b抗原和红细胞le(a+b+)表型；当fut3基因变异导致功能性的fut3酶缺陷时，无论个体是否具有功能性的fut2，其前体糖链均无法进一步形成le^a或le^b抗原，表现为红细胞le(a-b-)表型，即：fut2阳性，fut3阳性：le(a-b+)表型；fut2阴性，fut3阳性：le(a+b-)表型；fut2杂合，fut3阳性：le(a+b+)表型；fut3阴性le(a-b-)表型。

检测结果显示，本方法能提高检测的敏感性和准确性，有宜于对lewis血型抗原的相关基因fut2和fut3多肽性与多种疾病的疾病易感性的评估及判断，具有重要的临床意义。

sequencelisting

<110>复旦大学附属肿瘤医院

<120>一种lewis血型抗原检测方法

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