一种快速鉴定牛肉的方法与流程

本发明属于食品检测和动物分子生物学技术领域，涉及一种快速鉴定牛肉的方法，适用于鉴定未知样品是否是牛肉或是否含有牛肉成份。

背景技术：

随着我国居民生活水平的提高，仅国内生产的肉类远不能满足市场需求，需要从国外进口一部分肉类。这些因素为国内外不法商贩乘虚而入创造了条件。为保障消费者合法权益，确立有效的肉源性成份鉴定方法十分必要。

PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶链式反应，是20世纪80年代发明的集高度特异性、灵敏性、高效性为一体的分子生物学技术，广泛应用于涉及生物的诸多领域，包括物种鉴定、法学鉴定、药品/食品/饲料等诸多样品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分为传统PCR和实时荧光定量PCR (qPCR)。传统PCR又分为使用Taq DNA聚合酶和pfu等高保真DNA聚合酶的两种PCR。

在实际工作中Taq DNA聚合酶的传统PCR和实时定量PCR均在使用，前者通常耗时长，后者虽检测时间短，却存在试剂、耗材及检测设备昂贵的问题。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种快速鉴定牛肉的方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：一种快速鉴定牛肉的方法，包括以下步骤：

步骤1：设计特异性识别牛细胞色素b基因片段的1对引物；

步骤2：将牛肉总DNA的浓度调至20 ng/μL作为样品PCR检测的模板；

步骤3：使用步骤1的引物和步骤2的模板，借助PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR扩增牛细胞色素b基因特定片段；

步骤4：通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测步骤3的PCR扩增产物；

步骤5：根据步骤4的电泳检测结果，判断样品是否是或者是否含有牛肉或牛的其他组织成份。

所述牛细胞色素b基因片段的1对引物，上游引物碱基序列：5′-aatacactacacatccgacac-3′，下游引物碱基序列：5′-gacccgtaatataagcctcg -3′，浓度均为2 pmol/μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR扩增牛细胞色素b基因特定片段的PCR反应体系为10μL ，其中PrimeSTAR MAX Premix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；灭菌纯水3.5μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR扩增牛细胞色素b基因特定片段的PCR程序为：98℃变性/10 s，63℃退火/5 s，72℃延伸反应/5 s，30次循环。

所述根据步骤4的电泳检测结果，判断样品是否是或含有牛肉或牛的其他组织成份，若出现162 bp PCR产物，表明检测样品是或含有牛肉或牛的其他组织成份；反之不是或不含有牛肉或牛的其他组织成份。

本发明的有益效果：使用自行设计的识别牛细胞色素b基因片段的一组引物，结合TaKaRa公司的PrimeSTAR MAX DNA聚合酶（一种高保真DNA聚合酶），既解决了实时定量PCR成本高的问题，亦解决了传统Taq PCR耗时长的不足。本发明仅通过40分钟PCR和20分钟琼脂糖凝胶电泳共计1小时的时间即可完成样品是否是牛肉的鉴定，该发明可直接用于牛肉成份鉴定的试剂盒生产。

附图说明

图1为本发明实施例中以牛肉、猪肉、猪肝和羊肉为模板，使用特异性识别牛细胞色素b基因片段的引物，实施PCR获得产物的琼脂糖凝胶电泳检测的图谱。

具体实施例

现结合实施例，进一步说明使用本发明的引物结合PrimeSTAR MAX DNA聚合酶鉴定牛肉的良好效果。本发明使用杭州朗基MG96+型PCR仪，但并不限制使用其他公司的仪器。

制备完全相同的4组，分别以牛肉、猪肉、猪肝和羊肉总DNA为模板，其他条件相同，共计4管10μL PCR反应体系：PrimeSTAR MAX Premix：5μL；浓度均为2 pmol/μL的上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；灭菌纯水3.5μL。PCR程序如下：98℃变性/10 s，63℃退火/5 s，72℃延伸反应/5 s，30次循环。PCR完成后，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行实验结果检测。

结果表明，仅在以牛肉总DNA为模板的PCR样品中检测到一条位于100-250 bp位置的PCR产物，与预期结果162 bp相吻合，而以猪肉、猪肝和羊肉总DNA为模板进行PCR扩增的样品中，没有检测到特异性条带，表明本发明设计的引物优良特异性。