本发明属于微生物饲料发酵技术领域，涉及一种微生物发酵生产含共轭亚油酸发酵物的制备方法。
背景技术：
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid ，CLA)是由必需脂肪酸亚油酸衍生的共轭双烯酸的多种位置和几何异构体的总称。CLA是一种非常令人感兴趣的营养添加剂，已大量用于农业和食品工业。目前，尽管对CLA 的功能尚未有完整的了解，但CLA 已被证实具有重要的生理功能，包括抗癌，降低血液和肝脏胆固醇，强化免疫，促生长，改善肉品质，抑制脂肪沉积等。具有活性的CLA异构体主要存在于反刍（瘤胃）动物的乳脂及肉制品中，含量甚微(每克乳脂中含CLA 2～25 mg) ，难以富集，而且多种异构体并存，难以纯化。普通植物油中几乎不含CLA ，只有在一些稀有植物种子中发现有共轭多烯酸的存在，但未发现具有生理活性的异构体的存在。目前，CLA 作为一种天然的功能性脂肪酸被广泛应用于畜牧业中，具有减少体脂、提高动物生产性能、改善胴体品质等特殊生理功能，在畜禽生产中受到高度重视。
天然CLA 主要存在于反刍动物的乳脂及其肉制品中，是亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物作用下发生氢化反应然后在去饱和酶作用下生成的。在一些植物中也发现了CLA 的存在，但是含量非常少，动物产品中所含的CLA 较植物油中多。在动物中，反刍动物组织中CLA 含量较非反刍动物组织高。
天然CLA 的数量难以满足日常的使用需求，因此大量研究者通过其他方法合成能够使用的CLA。CLA 的化学合成一般以亚油酸或富含油酸、亚油酸的植物油( 如脱水蓖麻油、红花油、亚麻油、棉籽油、玉米胚芽油和葵花籽油) 为原料，采用生物化学的方法进行诱导异构化，可得到多种异构体的混合物，主要为cis- trans、trans - cis 异构体和少量的cis - cis、trans - trans 异构体。化学合成法的缺点是合成的CLA 是多种异构体的混合物，难以分离、纯化得到单个异构体，这也限制了产品的应用。因此，寻求一种新的方法替代化学合成。与化学合成相比，微生物发酵法的优点是反应条件温和，可以得到较单一的异构体，与天然食物中CLA 异构体组成相似，安全性较高，有利于产品的开发应用。
目前常用于微生物发酵产共轭亚油酸的菌株有乳酸菌、丁酸弧菌、瘤胃菌、丙酸杆菌、双歧杆菌等。这些菌株在合适的基料中培养，然后在一定条件下转化亚油酸生成CLA，这缘于所筛选的菌株在生长过程中可产生亚油酸异构酶，该酶具有专一性，能将底物亚油酸转化为特定的、比较纯的活性异构体，所以利用乳酸菌等微生物来生产CLA 具有非常重大的意义。然而微生物发酵产共轭亚油酸方法的缺点是生产CLA 的菌株大多数为严格厌氧菌，在工业或实验室中不易培养且产量较低，难以广泛应用；过量的游离亚油酸和副产物的生成会抑制产CLA 菌株的生长，从而影响其转化率；亚油酸在水中的溶解度低，会阻碍转化效率。因此，需要寻找新的发酵方法解决现有的技术以及已有专利存在的问题。
技术实现要素：
为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种微生物发酵生产含共轭亚油酸发酵物的制备方法，它能够解决目前天然共轭亚油酸数量难以满足日常的使用需求，具有转化率高、产量较大、应用广发等特点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种微生物发酵生产含共轭亚油酸发酵物的制备方法，其制备步骤是：
（1）配制发酵基质：选取适量的米糠、大豆粉及大米粉，并将各原料通过95 kw隧道式微波机进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用1.0mm筛片的粉碎机进行粉碎制得发酵基质；
（2）配制菌种混合液：先按照料液比1: 7的比例准备好乳酸杆菌和啤酒酵母菌种，再选取适量米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入适量的水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入适量液化酶，酶解2～4h，将发酵罐的温度降至65℃，加入适量糖化酶，酶解24～48h，酶解结束后，将温度降至到37℃，将已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵，制得菌种混合液；
（3）将步骤（2）制得的菌种混合液通过流量计计量后与步骤（1）配制好的发酵基质通过搅拌机混合搅拌均匀后经输送至滚筒中进行发酵，得到发酵混合物；
（4）将发酵混合物加入烘干机进行烘干，烘干降温后进行粉碎，得到富含有共轭亚油酸发酵物。
所述步骤（1）中各物质质量百分比配方为米糠50-90%，大豆粉5-40%，大米粉，5-10%。
在所述步骤（2）中菌种混合液与发酵基质混合时控制混合物中的水分为35%。
所述步骤（2）发酵前1～3 d进行有氧发酵，温度控制在25～32℃，每隔2～4 h输入过滤空气，发酵72小时后停止输入过滤空气；第4～25 d后为厌氧发酵，发酵温度控制在35～42℃，每隔2小时转动5～10 min。
所述共轭亚油酸发酵物含有共轭亚油酸≥6.0%。
本发明的积极效果是：它能够解决目前天然共轭亚油酸数量和品质难以满足日常的使用需求，具有转化率高、产量较大、应用广发等特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
一种微生物发酵生产含共轭亚油酸发酵物的制备方法，其制备步骤是：
（1）配制发酵基质：选取适量的米糠、大豆粉及大米粉，并将各原料通过95 kw隧道式微波机进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用1.0mm筛片的粉碎机进行粉碎制得发酵基质；
（2）配制菌种混合液：先按照料液比1: 7的比例准备好乳酸杆菌和啤酒酵母菌种，再选取适量米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入适量的水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入适量液化酶，酶解2～4h，将发酵罐的温度降至65℃，加入适量糖化酶，酶解24～48h，酶解结束后，将温度降至到37℃，将已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵，制得菌种混合液；
（3）将步骤（2）制得的菌种混合液通过流量计计量后与步骤（1）配制好的发酵基质通过搅拌机混合搅拌均匀后经输送至滚筒中进行发酵，得到发酵混合物；
（4）将发酵混合物加入烘干机进行烘干，烘干降温后进行粉碎，得到富含有共轭亚油酸发酵物。
所述步骤（1）中各物质质量百分比配方为米糠50-90%，大豆粉5-40%，大米粉，5-10%。
在所述步骤（2）中菌种混合液与发酵基质混合时控制混合物中的水分为35%。
所述步骤（2）发酵前1～3 d进行有氧发酵，温度控制在25～32℃，每隔2～4 h输入过滤空气，发酵72小时后停止输入过滤空气；第4～25 d后为厌氧发酵，发酵温度控制在35～42℃，每隔2小时转动5～10 min。
所述共轭亚油酸发酵物含有共轭亚油酸≥6.0%。
具体实施例1
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠10000kg，大豆粉8000kg，大米粉2000kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用粉碎机（1mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1: 7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母培养基。具体操作步骤如下：
A．将1 000 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷却到95 ℃，加入300 mL液化酶，酶解1 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解24h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵24h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，倒入滚筒中进行发酵，发酵前3d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔4 h输入过滤空气，第4d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制在不高于115℃，出口温度控制为小于65℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。
具体实施例2
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠12000 kg，大豆粉6000 kg，大米粉2000 kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用粉碎机（1 mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1: 7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母的培养基。具体操作步骤如下：
A．将1000 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入300 mL液化酶，酶解2 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解36h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵36h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，倒入滚筒中进行发酵，发酵前3d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔4 h输入过滤空气；第4d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制不高于115℃，出口温度控制小于60℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。
具体实施例3
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠14000kg，大豆粉4000kg，大米粉2000kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用粉碎机（1mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1:7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母培养基。具体操作步骤如下：
A．将1 080 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7.5m3水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵24h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，倒入滚筒中进行发酵，发酵前3d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔4 h输入过滤空气，第4d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制不高于115℃，出口温度控制为小于65℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。
具体实施例4
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠16000kg，大豆粉2000kg，大米粉2000kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4min，冷却后再用粉碎机（1mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1:7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母培养基。具体操作步骤如下：
A．将1 000 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵48h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，发酵前4d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔4 h输入过滤空气，第5d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制不高于115℃，出口温度控制为小于60℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。
具体实施例5
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠17000kg，大豆粉1000kg，大米粉2000kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用粉碎机（1mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1:7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母培养基。具体操作步骤如下：
A．将1 000 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵48h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，倒入滚筒中进行发酵，发酵前4d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔4 h输入过滤空气，第5d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制不高于115℃，出口温度控制为小于60℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。
具体实施例6
（1）配制发酵基质：按照下列发酵基质配方配制发酵物，米糠18000kg，大豆粉1000kg，大米粉1000kg，将上述配方中各种原料通过隧道式微波机（95 kw）进行微波处理，微波时间为4 min，冷却后再用粉碎机（1mm筛子）进行粉碎。
（2）菌种制备，按照料液比1:7的比例准备好的乳酸杆菌和啤酒酵母。具体操作步骤如下：
A．将1000 kg米粉倒入10 m3的发酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷却到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再将发酵罐的温度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解结束后，将温度降至到37℃。
B．配制菌种混合液：将2000mL已经活化好的乳酸杆菌和啤酒酵母菌种加入酶解好10 m3米乳罐中进行扩培，37℃温度发酵48h，作为发酵种子，备用。
（3）将扩培后的发酵种子与粉碎后的发酵基质混合，混合时控制混合物中的水分为35%，混合均匀倒入滚筒中进行发酵，倒入滚筒中进行发酵，发酵前4d进行有氧发酵，温度控制在28℃，每隔24h输入过滤空气，第5d后为厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，停止输入过滤空气，每隔2小时转动5～10分钟，发酵25d。
（4）将滚筒中发酵好的固态发酵物加入到烘干机中进行烘干，烘干时入口温度控制不高于115℃，出口温度控制为小于60℃，烘干50 min后物料进行降温粉碎，然后进行包装。