一种用于甘薯黑斑病抗性鉴定中的黑斑病菌培养方法与流程

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及用于甘薯黑斑病抗性鉴定中的黑斑病菌培养方法。

背景技术：

甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料用作物，甘薯黑斑病(sweetpotato black rot)是危害甘薯最普遍的储藏期病害，我国每年由甘薯黑斑病造成的甘薯损失约10％左右，它是由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis etHalsted)侵染引起的，是甘薯生产上一种重要病害，在我国各甘薯产区均有发生。该病能造成甘薯储藏时烂窖，育苗时烂床和死苗，对甘薯生产影响极大。且病薯毒害较大，如用病薯喂养牲畜，会发生气喘病而死亡；用病薯酿酒，则发酵迟缓并降低酒精的产量与质量，严重制约甘薯产业的发展。甘薯黑斑病可通过种薯、薯苗及土壤等多种途径传播，很难彻底根除，由于甘薯黑斑病是一种传播途径较多的顽固性病害，目前大多采用综合防治的方法加以控制，其中选育抗黑斑病甘薯品种是防治黑斑病的重要途径之一。而黑斑病抗性鉴定是甘薯抗病育种的基础，然而目前生产上采用的甘薯黑斑病抗性鉴定方法仍有不足，尤其是病原菌的扩大培养，通常采用薯片法获得孢子悬浮液，不仅薯片易腐烂，也容易混入杂菌、耗时较长，因此无法科学高效地对甘薯品种黑斑病的抗性做出评价。

技术实现要素：

针对现状，本发明提供了一种用于甘薯黑斑病抗性鉴定中的黑斑病菌培养方法，该方法科学高效、操作简单，缩短黑斑病菌孢子悬浮液制备时间的同时，减少杂菌的污染，在甘薯黑斑病抗性鉴定中能够精确全面反映甘薯品种对黑斑病的抗性水平。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于甘薯黑斑病抗性鉴定中的黑斑病菌培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

(1)病原菌分离和纯化：从田间采集黑斑病发病薯块，通过组织分离法分离黑斑病菌，分离时洗去薯块表面泥土，并用75％酒精进行表面消毒，在超净工作台上将病斑表皮去除，取病斑部并切成小块接种在PDA培养基上培养，经分离纯化和柯赫氏法验证确定为黑斑病菌；

(2)甘薯液体培养基制备：将2g薯块(薯块颜色为白色最佳)，加水煮沸并搅拌，使薯块彻底匀浆在溶液中，纱布过滤，将滤液高压灭菌；

(3)黑斑病菌的培养和孢子悬浮液制备：将分离纯化的黑斑病菌接入甘薯液体培养基中培养20-24h，纱布过滤去除菌丝后，在转速为4000-6000rpm的离心机中离心5min，之后用无菌水悬浮获得孢子悬浮液，并将其OD₆₀₀调至1.0。

本发明的有益效果是：

1、利用甘薯液体培养基对分离纯化的甘薯黑斑病菌进行活化、扩大培养，极大地缩短了黑斑病菌的增殖时间，且不易污染。

2、该鉴定方法科学，结果准确，过程简单易于操作。

附图说明

图1是本发明利用薯片培养黑斑病菌分生孢子示意图；

图2是本发明黑斑病菌孢子悬浮液的制备过程示意图；

具体实施方式

下面将描述本发明的具体实施例。应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

申请人通过本发明方法和传统的薯片法培养黑斑病菌进行对比，来说明本发明的优点。具体如下：

实施例

实施例中对照组是采用薯片法培养黑斑病菌，实验组采用本发明方法培养黑斑病菌。具体实验过程如下：

(1)病原菌分离和纯化：从田间采集黑斑病发病薯块，通过组织分离法分离黑斑病菌。分离时洗去薯块表面泥土，并用75％酒精进行表面消毒，在超净工作台上将病斑表皮去除，取病斑部并切成小块。

A:对照组将病斑部放入容器内捣碎，加适量水兑成黑斑病孢子悬浮溶液。

B:实验组将病斑部接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养，经分离纯化和柯赫氏法则验证确定是黑斑病菌。

(2)黑斑病菌的培养和孢子悬浮液制备：

A:对照组选择无病斑薯块洗净切成厚约1cm的薯片，大小以薯块大小定，把切好的薯片放入配好的孢子悬浮液内浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入准备好的经消毒过的10cm直径的培养皿内(培养皿内垫有保湿纸)，盖上培养皿，在25℃恒温培养箱内保持相对湿度95％以上培养至薯片表面长满浅灰色的分生孢子，约5-6d(见图1)。待薯片长满灰白色的分生孢子后，用无菌水冲洗，配成浓孢子悬浮液备用。将浓孢子悬浮液稀释为1×10⁷个孢子/ml(或显微镜160倍下每视野40-60个孢子)的悬浮液备用。

B:实验组取2g薯块(薯块颜色白色为宜)，加水煮沸并搅拌，使薯块彻底匀浆在溶液中，纱布过滤，将滤液高压灭菌制备甘薯液体培养基。将分离纯化的黑斑病菌接入甘薯液体培养基中培养20-24h，纱布过滤去除菌丝后，6000rpm离心5分钟，之后用无菌水悬浮获得孢子悬浮液(见图2)，并将其OD₆₀₀调至1.0。

(3)参试薯块准备：以徐薯18为对照品种，宁6-10、宁29-8、宁28-4、宁6-8、宁104-2、宁26-2、徐紫薯5号和徐薯33为实验品种(系)，各选取3块中等大小、表面光滑、无伤烂的薯块，清洗晾干后75％酒精消毒晾干，编号待用。

(4)病原菌接种与薯块处理：采用针刺接种法接种，用医用注射针头蘸取配好的菌液，穿刺测试的薯块进行接种，每个薯块接种15个点(注意：每针刺1次，针头需蘸取菌液)，深度0.5cm。接种后的薯块装入消毒的塑料箱中，加盖消毒纱布，置于25-28℃的恒温室中，每天上午、下午各用温水浇湿覆盖纱布一次进行保湿。

(5)发病情况调查：接种10d后，切开薯块测量病斑直径和深度，计算平均病斑直径和平均深度，与对照品种相比判定抗性(注意：与本箱对照相比)。抗病表现百分率按以下公式计算：

抗病表现百分率单位为％，精确到0.1％。

根据抗病表现百分率将甘薯黑斑病抗性分为五级，具体见表1。

表1 抗病性分级情况

选用不同的甘薯品种(系)进行对比，对比结果见表2。对表2的对比结果可以看出，本发明培养方法使用本发明方法培养黑斑病菌与薯片法培养黑斑病菌在甘薯黑斑病抗性鉴定结果上基本一致，但使用本发明方法培养黑斑病菌过程更简单、易于操作，能极大地缩短黑斑病菌的增殖时间，并且病原菌不易被污染，可以有效避免因薯片法病原菌培养的薯片易腐烂、杂菌多、时间长等引起的误差，使甘薯黑斑病抗性鉴定更为精准高效。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。