用于三维打印的粘土基水凝胶基质及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于三维打印的粘土基水凝胶基质及其制备方法和应用。

背景技术：

水凝胶是一种通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联构成的具有三维网状结构、能在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解的聚合物.由于天然或合成的聚合物水凝胶在结构及性能上与生物体组织相似，因此近20年来，水凝胶一直是生物医用工程领域，特别是组织工程方面的诊断、治疗、修复或替换人体组织器官或增进其功能与生长因子、药物和基因载体等的一个研究热点。

热聚合、紫外聚合是水凝胶制备中较常用的聚合方法。其中热聚合在凝胶体系中加入热引发剂后，聚合时间不可控，需要随时调整打印时所需压力，或可能由于聚合过快，造成后期无法打印的问题。而采用紫外光对三维支架进行固化，则不存在上述问题，它可以在打印凝胶浆料的同时对其进行固化，但该方法对凝胶浆料的要求较高，需要其在较短时间内发生紫外交联成胶，否则打印出的凝胶支架的结构无法良好地保持，因此大大缩小了材料的可选择性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种可用于三维打印中紫外光固化的粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质包括特定配比的无机黏土、带碳碳双键的生物相容大分子、紫外光引发剂和水，其配方简单、成分安全，所述粘土基水凝胶基质在经紫外光交联前具有一定的预形状，可实现先打印，后固化成胶，批量打印三维凝胶支架，大大提高了三维打印效率。

第一方面，本发明提供了一种用于三维打印的粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：10-50％；

无机粘土：3-20％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：30-86％；

上述各原料组分的总质量百分含量为100％；其中，所述交联剂为带碳碳双键的生物相容大分子，所述生物相容大分子为聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、透明质酸中的一种或多种。

本发明通过上述特定质量配比的各种原料的协同作用，获得的所述粘土基水凝胶基质具有适宜的打印粘度和强度，在紫外光交联前具有一定的预形状。在常温下可以将所述粘土基水凝胶基质打印成力学强度、拉伸性能较好的稳定三维凝胶支架前驱体，便于后期对支架前驱体进行统一的紫外光固化，得到三维凝胶支架。所述粘土基水凝胶基质适用于批量打印制得三维打印凝胶支架，大大提高了三维打印效率，非常适合工业化生产。

在紫外光的作用下，本申请的所述粘土基水凝胶基质中，所述交联剂的碳碳双键之间发生交联，形成的聚合物长链穿插在无机黏土的有序片层结构中，形成三维网络结构的水凝胶，使得凝胶形状得以保持，同时无机粘土也充当物理交联的作用，其与带碳碳双键的生物相容大分子之间形成的氢键作用、范德华力等，也使得打印出的三维凝胶支架的强度进一步提高，充分发挥物理交联与化学交联的协同效应。提高凝胶支架的稳定性。

所述无机粘土可以选自高岭土、膨润土、蒙脱土、锂皂石(laponite，锂藻土)、锂蒙脱石(hectorite)、贝得石、皂石、硅镁石、硅酸镁铝、其它硅酸铝和各种其它天然和/或合成的粘土，以及它们的组合。

优选地，所述无机粘土的粒径不超过500nm。进一步优选为50-200nm。

在本发明的一优选实施方式中，所述无机粘土为锂皂石粘土。该锂皂石粘土可以在水中快速剥离分散成单片层，形成无色透明的胶体分散液，稳定性好。该黏土可以为购买自Rockwood公司的Laponite XLG。Laponite XLG是合成的层状粘土(layeredclay)，与天然蒙脱石类似。

本申请中，无机黏土的加入，可有效提高水凝胶支架的强度，无机黏土相当于充当了物理交联剂的作用。此外，控制所述无机黏土的含量可以调控所述粘土基水凝胶基质的粘度，使所述粘土基水凝胶基质具有一定的预形状，可以实现先打印后固化。

优选地，所述粘土基水凝胶基质的粘度为30-350Pa·s。待打印的所述粘土基水凝胶基质应该具有一定的粘度，粘度过高，流动性较差，打印时需要的压力过大，且材料不容易混匀；溶液黏度过低，流动性太高，打印时塑形困难，支架会发生塌陷，无法保持预形状。本申请中，将无机粘土的含量控制在3％-20％之间，可以使所述粘土基水凝胶基质的粘度控制在30-350Pa·s。

进一步优选地，所述无机黏土的质量百分含量为5-15％。更优选为8-15％。当所述无机黏土的质量百分含量提高至8％以上，所述粘土基水凝胶基质达到较高的黏度，其打印成的凝胶支架前驱体经固化后，固化的凝胶支架的拉伸率可以达到5000％左右，力学强度有了明显提高。

优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：10-50％；

无机粘土：5-15％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：35-84％；

上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

进一步优选地，所述粘土基水凝胶基质的粘度为50-250Pa·s。更优选为100-200Pa·s。

本申请中，带碳碳双键的生物相容大分子的成胶效果较好，在所述无机粘土与水形成的分散液中，不需要额外添加化学交联剂，经紫外光聚合，即可得到强度较高的凝胶结构。形成的三维凝胶支架的毒性低，细胞相容性好。在提供细胞(例如成骨细胞以及骨髓间充质干细胞)生长所需的三维环境的同时，对细胞起到促进其黏附、生长与增殖的作用。

在本发明一实施方式中，所述交联剂的分子链的至少一端带有碳碳双键。所述交联剂可以为甲基丙烯酸、丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)修饰的明胶、透明质酸、聚乙烯醇等。例如可以是甲基丙烯酸修饰的明胶，丙烯酸修饰的透明质酸、丙烯酸修饰的聚乙烯醇、低分子量(分子量小于1000道尔顿)的PEGDA修饰的壳聚糖等。

在本发明另一实施方式中，所述交联剂的分子链的至少一端带有碳碳双键，所述交联剂的分子链中间为聚乙二醇的主链结构。

进一步优选地，所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。

所述交联剂除了可促进凝胶形成、提高凝胶力学强度外，还可以通过控制其分子量和固含量，以达到控制细胞在制得的支架上黏附、生长、增殖甚至分化等目的。例如，聚乙二醇分子量为4000，固含量为20％时，细胞能够在支架上黏附及伸展情况良好；但当聚乙二醇的分子量为10000以上时，细胞在支架上成球形，不能很好地展开，细胞增殖行为相对较弱。

优选地，所述交联剂中，聚乙二醇的主链结构的分子量为1000-10000。例如可以为2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000或9000。进一步优选为2000-8000。

本申请中，所述交联剂的质量百分含量为10-50％。例如可以为15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。进一步优选为20-40％。

优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：20-40％；

无机粘土：3-20％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：40-76％；

上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

进一步优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：20-40％；

无机粘土：5-15％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：45-74％；

上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

本申请中所选用的紫外光引发剂为生物相容性良好的引发剂，其用量极少，且几乎不会对后期三维凝胶支架的细胞实验产生影响。

在本发明一实施方式中，所述紫外光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2’，2’-二甲基乙酮(Irgacure2959)、1-羟基环己基苯基酮、α,α’-二甲氧基-α-苯基苯乙酮和2-甲基-1-(4-甲硫基苯基)-2-吗啉-1-丙酮中的一种或多种。并不限于本申请所列举的这几种。

优选地，所述水的质量百分含量为35-84％。进一优选为40-76％。更优选为45-74％。

第二方面，本发明提供了一种上述用于三维打印的粘土基水凝胶基质的制备方法，包括以下步骤：

按上述配方量，称取交联剂、无机黏土、紫外光引发剂，加入水混合均匀，得到所述粘土基水凝胶基质，上述各原料按如下质量百分含量混合：

交联剂：10-50％；

无机粘土：3-20％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：30-86％；

上述各原料组分的总质量百分含量为100％；其中，所述交联剂为带碳碳双键的生物相容大分子，所述生物相容大分子为聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、透明质酸中的一种或多种。

本发明实施例第二方面提供的制备方法，工艺简单，制备得到的所述粘土基水凝胶基质的粘度合适，具有一定的预形状，可实现先打印，后固化成胶，适用于批量打印三维凝胶支架，大大提高了三维打印效率。

本发明第三方面提供了一种三维凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)取本发明第一方面的所述粘土基水凝胶基质，将其在常温下进行三维打印，得到三维凝胶支架前驱体；

(2)将所述三维凝胶支架前驱体置于紫外光下进行交联固化，得到三维凝胶支架。所述三维凝胶支架由无机黏土、带碳碳双键的生物相容大分子、紫外光引发剂通过紫外光聚合而成。

优选地，所述交联固化的时间为1200s-3000s，即30-50min。

优选地，所用紫外光的能量密度为0.1-999,990μJ/cm²。

进一步优选为100-500mJ/cm²。更优选为120mJ/cm²。

优选地，所用紫外光的波长为230-400nm。进一步优选为250-350nm。更优选为254nm。

三维打印技术可以对支架的孔径、孔隙、连通率等进行灵活调控。需要调控气压、间距、层高等参数来获得所期望的支架。一般而言，所述粘土基水凝胶基质的粘度较大时，打印所需的气压较大，粘度较小时，打印所需要的气压较小。打印时支架的行间距越大，最终得到的三维凝胶支架的孔隙率越大，支架的压缩强度越小。

本发明实施例中，所述三维凝胶支架前驱体、三维凝胶支架为规则的几何体(如长方体、正方体、圆柱体等，但不限于此)以及其他不规则的三维多孔结构体。优选为规则几何体。进一步优选为长方体。

本发明一实施例中，所述三维凝胶支架的底面边长为10-30mm，高度为3-8mm，行间距为200-500μm，但不限于此，本领域技术人员可根据具体细胞培养条件选择并制备合适的相应大小的三维凝胶支架。

本发明一实施例中，所述三维凝胶支架的孔隙率为70-95％。

所述三维凝胶支架上形成有多个孔洞，所述孔洞的孔径为200-600μm。

本发明第三方面提供的所述三维凝胶架的制备方法中，采用上述特定配比的无机粘土、交联剂、紫外光引发剂、水构成的所述粘土基水凝胶基质(黏土基凝胶支架的三维打印浆料)，所述粘土基水凝胶基质的粘度合适，具有一定的预形状，适合连续、批量打印，固化后得到三维凝胶支架，大大提高了三维打印效率。所述三维凝胶支架的制备方法，工艺简单，可控性强，能耗较低，无需改变打印过程中的压力，制造成本低廉，实用性较强。

第四方面，本发明还提供了如本发明第三方面所述的三维凝胶支架的制备方法得到的三维凝胶支架。

第五方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的粘土基水凝胶基质或如本发明第四方面所述的三维凝胶支架在制备组织修复材料中的应用。优选为在骨组织修复材料的应用。

本发明实施例的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1是分子量分别为4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(A，C)的核磁图谱；

图2为Rockwood公司生产的Laponite XLG黏土(a)、双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(b，c)以及其分别与上述粘土交联形成凝胶支架后的红外图谱(d，e)；

图3为成骨细胞在本发明实施例1-3制得的黏土基三维凝胶支架上铺展的扫描电镜图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。其中，本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。

下述实施例中所用的聚乙烯醇为市售商品，(1788型，醇解度87-89％，阿拉丁)；所述羟基磷灰石购买自南京埃普瑞纳米材料有限公司，医用级。

若无特别说明，本发明实施例所采用的试剂皆为市售商品。

实施例1：

一种黏土基三维凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

A.双键修饰的聚乙二醇(Mn＝4000)大分子交联剂的制备

首先将1.2ml的丙烯酰氯溶于10ml二氯甲烷中，配制成丙烯酰氯溶液。随后将10g的聚乙二醇(Mn＝4000)置于50ml的三口烧瓶中，加入20ml的二氯甲烷溶解，室温下搅拌均匀。在冰水浴条件下，缓慢加入2.1ml的三乙胺溶液。随后，在冰水浴条件下，逐滴加入提前配置好的丙烯酰氯溶液。控制体系温度为零度，直至丙烯酰氯全部滴加完毕，氮气保护状态下，室温反应24h。反应结束后，滤去体系中形成的三乙胺盐酸盐，并用无水乙醚沉淀出合成出的双键修饰的聚乙二醇(Mn＝4000)，得到的粗产物经过真空干燥1d、透析7d、过滤、冻干2d后得到纯度较高的双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂，即为聚乙二醇二丙烯酸酯，其分子式为CH₂＝CHCO-(OCH₂CH₂)_nOCOCH＝CH₂(n为88)。

B.可用于三维打印的紫外光固化纳米粘土基水凝胶基质的制备

将步骤A得到的双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂(Mn＝4000)、Laponite XLG锂皂石粘土、紫外光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮与水相混合，其中，上述各原料按如下质量百分含量混合：

聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝4000)20％

Laponite XLG粘土：5％

紫外光引发剂：0.05％

水：74.95％；

室温下混合均匀后，得到可用于三维打印的紫外光固化粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质的粘度为160Pa·s。

C、支架制备：

按照所期望的支架结构来设置打印参数，将上述粘土基水凝胶基质在常温下进行三维打印，得到三维凝胶支架前驱体，该三维凝胶支架前驱体的三维打印参数为底面边长为15mm，高度为5mm，支架行间距为300μm；

将打印好的所述三维凝胶支架前驱体置于紫外交联仪中，在254nm下进行光固化25min，得到黏土基三维凝胶支架。检测该黏土基三维凝胶支架的孔隙率为75％，支架压缩强度为1MPa。

实施例2：

一种黏土基三维凝胶支架的制备方法的方法，包括如下步骤：

(1)采用与实施例1相同的方法，对分子量为4000的聚乙二醇进行双键修饰，得到交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯，CH₂＝CHCO-(OCH₂CH₂)_nOCOCH＝CH₂(n为88)；

(2)采用2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮作为紫外光引发剂，Laponite XLG作为无机黏土，按下述配方量，称取交联剂、无机黏土、紫外光引发剂，加入水混合均匀，得到粘度为170Pa·s的粘土基水凝胶基质，上述各原料按如下质量百分含量混合：

交联剂：30％；

无机粘土：8％；

紫外光引发剂：0.05％；

水：61.95％；

(3)将上述粘土基水凝胶基质在常温下进行三维打印(打印参数同实施例1)，得到三维凝胶支架前驱体，将打印好的将打印好的所述三维凝胶支架前驱体置于紫外交联仪中，在254nm下进行光固化40min后，得到黏土基三维凝胶支架。

实施例3：

一种黏土基三维凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用与实施例1相同的方法，对分子量为10000的聚乙二醇进行双键修饰，得到交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯，CH₂＝CHCO-(OCH₂CH₂)_nOCOCH＝CH₂(n为224)；

(2)采用2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮作为紫外光引发剂，Laponite XLG作为无机黏土，按下述配方量，称取交联剂、无机黏土、紫外光引发剂，加入水混合均匀，得到粘度为150Pa·s的粘土基水凝胶基质，上述各原料按如下质量百分含量混合：

交联剂：20％；

无机粘土：7％；

紫外光引发剂：0.05％；

水：72.95％；

(3)将上述粘土基水凝胶基质在常温下进行三维打印(打印参数同实施例1)，得到三维凝胶支架前驱体，将打印好的将打印好的所述三维凝胶支架前驱体置于紫外交联仪中，在254nm下进行光固化20min后，得到黏土基三维凝胶支架。

图1为分子量分别为4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(A，C)(即聚乙二醇二丙烯酸酯)的核磁图谱。即(A)为PEGDA4000，(B)为PEG 4000，(C)为PEGDA 10000,(D)PEG 10000。其中聚乙二醇二丙烯酸酯的结构式如下式(Ⅰ)所示：

从图1可以看出，c,d,e为聚乙二醇二丙烯酸酯上修饰的双键上氢元素的特征峰，说明双键被成功地修饰到聚乙二醇上。

图2为Rockwood公司生产的Laponite XLG黏土(a)、双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(b，c)以及其分别与上述粘土交联形成凝胶支架后的红外图谱(d，e)。图2中D，E分别为实施例2、3中的所述粘土基水凝胶基质形成的黏土基三维凝胶支架的红外图。

从图2可以看出，d，e不仅具有Laponite XLG粘土的红外特征峰，还具有乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)在2887，1725，1110，1467cm^-1处的特征峰，以上特征峰分别代表PEGDA上C-H键，C＝O双键，C-O-C的伸缩振动吸收峰，以及-CH₂-的摇摆振动吸收峰，说明粘土基复合凝胶成功地被制备出来。

图3为成骨细胞在本发明实施例1-3制得的黏土基三维凝胶支架上铺展的扫描电镜图。从图3可以看出，成骨细胞(图中方框处为细胞)成功粘附在三维凝胶支架上的孔洞的孔壁上。

实施例4：

一种黏土基三维凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用与实施例1相同的方法，对分子量为4000的聚乙二醇进行双键修饰，得到交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯，CH₂＝CHCO-(OCH₂CH₂)_nOCOCH＝CH₂(n为88)；

(2)采用α,α’-二甲氧基-α-苯基苯乙酮作为紫外光引发剂，膨润土作为无机黏土，按下述配方量，称取交联剂、无机黏土、紫外光引发剂，加入水混合均匀，得到粘度为190Pa·s的粘土基水凝胶基质，上述各原料按如下质量百分含量混合：

交联剂：25％；

无机粘土：10％；

紫外光引发剂：0.1％；

水：74.9％；

(3)将上述粘土基水凝胶基质在常温下进行三维打印，得到三维凝胶支架前驱体，该三维凝胶支架前驱体的三维打印参数为底面边长为15mm，高度为5mm，支架行间距为500μm；

将打印好的所述三维凝胶支架前驱体置于紫外交联仪中，于254nm、120mJ/cm²的能量密度下，进行光固化20min后，得到黏土基三维凝胶支架。

实施例5

一种用于三维打印的紫外光固化粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：40％；

无机粘土：15％；

紫外光引发剂：0.05％；

水：44.95％；

其中，所述交联剂为甲基丙烯酸修饰的明胶；所述无机黏土为高岭土，所述紫外光引发剂为2-甲基-1-(4-甲硫基苯基)-2-吗啉-1-丙酮。

实施例6

一种用于三维打印的紫外光固化粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

交联剂：50％；

无机粘土：12％；

紫外光引发剂：0.08％；

水：37.92％；

其中，所述交联剂为丙烯酸修饰的透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯(实施例1中制得)；所述无机黏土为高岭土，所述紫外光引发剂为1-羟基环己基苯基酮。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。