内生细菌HB3S‑20及在棉花黄萎病防治中的应用的制作方法

本发明涉及植物病害的生物防治，具体涉及棉花的内生细菌HB3S-20及其在棉花黄萎病防治中的应用。

背景技术：

棉花黄萎病(Verticilliumwilt of cotton)是棉花上的一种重要病害，棉花黄萎病是由大丽轮枝菌( Verticillium dahliae Kleb. ) 引起的土传病害，它能导致棉花严重减产甚至植株死亡，已成为发展棉花生产的主要限制因子之一。棉花黄萎病的常规防治方法有抗病品种的培育、农业措施和化学防治等；但是，抗病品种的培育周期长，相关农业措施的难以实施，化学防治对环境破坏的不可逆性等等这些特点都严重制约了传统防治方法的实现。鉴于此, 人们致力于寻找有效防治棉花黄萎病的替代方法。生物防治由于其对环境的友好性被认为是一种颇有应用前景的方法，利用生物防治对棉花黄萎病进行防治，能在改善作物生长和产量的同时确保自然环境的安全，具有可持续发展的战略意义。

利用有益微生物来防治棉花黄萎病的研究，目前国内研究得较为透彻并已经规模化生产的一个例子是枯草芽孢杆菌制剂，其生物防治的作用机理主要是是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有较好的效果，但是在生产应用中也存在一些问题，比如枯草芽孢杆菌剂在不同年份效果不是很稳定。因此，有必要发掘出对棉花黄萎病的防治更加有效和丰富的大量菌种资源，为棉花黄萎病的生物防治提供材料，并为将来生物源农药的开发奠定相应的基础。

植物内生菌是指那些其生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内的微生物，植物内生菌作为一个巨大的资源库，具有丰富的利用价值，很多内生菌对植物具有促生作用和防病作用，其在生物防治中的作用得到了研究者们越来越多的关注，内生细菌作为生防菌的优势在于细菌生长繁殖快，便于大规模的发酵生产和保存。细菌防治植物病害的机制主要有拮抗作用，营养和位点的竞争作用，重寄生作用以及诱导植物抗性的作用。拮抗作用是指生防菌能够产生抗生物质，这种抗生物质能够对病原菌的生长和繁殖产生抑制作用。竞争作用主要是营养和空间的竞争。重寄生作用则依赖于生防菌能够产生溶解病原真菌细胞壁的细胞水解酶。本研究从棉花的内生细菌入手，经过多年的研究，筛选出一株对黄萎病菌具有抑制活性并对棉花黄萎病控制效果较好的生防细菌。

技术实现要素：

本发明的目的有两个，本发明的第一目的是提供棉花内生细菌HB3S-20。

本发明的另外一个目的在于提供上述棉花内生细菌HB3S-20在棉花黄萎病防治中的应用。

本发明从棉花的内生细菌入手，通过分离、筛选、鉴定、抑菌测定及温室的生物防效的测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的内生细菌HB3S-20，已于2016年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，该细菌HB3S-20鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida HB3S-20，其保藏编号为：CCTCC NO：M2016608。

本发明的细菌HB3S-20是一株棉花的内生细菌，在分离时，首先要选择健康的棉株，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离到的是棉花的内生细菌。

菌株HB3S-20对棉花黄萎病菌的生长具有较好的抑制效果，在PDA 培养基上，菌株HB3S-20和大丽轮枝菌Verticillium dahliae（V991）对峙培养时，能够形成明显的抑菌带，表明其对黄萎病菌的生长具有拮抗作用，其抑菌率为28.60%。

HB3S-20与Verticillium dahliae在PDA上的对峙培养

菌株HB3S-20对棉花黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长具有较好的抑制效果，将PDA培养基冷却至50~55℃，将黄萎病菌孢子液均匀地混入其中，将20µl菌液加入到PDA平板中已被6mm打孔器处理后的空孔中，2d后观察黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长的情况，发现HB3S-20对黄萎病菌孢子的萌发和菌丝生长均有很好的抑制作用。

温室条件下菌株HB3S-20对黄萎病的防控效果好，菌株HB3S-20与黄萎病菌V991孢子液混合接种后30d的病情指数和仅接种黄萎病菌孢子液的病情指数在3次结果中分别为28.33和70.83；28.57和73.33；30和90.01，表现出较为稳定的防效。试验重复3次，3次结果表明HB3S-20对棉花黄萎病的平均防效为62.57%,表现出较好的生防活性，结果见表1。

表1HB3S-20对棉花黄萎病的温室防效

利用利福平筛选出抗300µg /ml Rifampicin的HB3S-20抗性菌株，用HB3S-20抗性菌株接种健康的2叶期棉苗的根部，分别在接种后1d、3d、5d、7d、9d和11d从棉花根部和茎部分离抗性菌株，结果表明从处理组棉株的根部和茎部均能够分离得到抗性菌株(对照并不能分离到)，说明HB3S-20能够很好的定殖在棉花的根部和茎部。

另外，生防菌株HB3S-20（恶臭假单胞菌Pseudomonas putida）对棉花的出苗率和棉花生长没有负面影响：菌株HB3S-20菌液浸泡种子14h后的棉株的出苗率为74.67%，对照组清水处理后种子的出苗率为75.5%，说明其对种子出苗率的影响小，与对照相比，菌株HB3S-20菌液处理种子20d后棉株的根长与对照相比没有显著差异，但棉株的株高和鲜重有显著差异，结果见表2。

表2 菌株HB3S-20菌液浸泡棉种后的出苗率和各生长指标

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、从棉花茎部和根部分离大量内生真菌和细菌，利用盆栽实验筛选到一株对棉花黄萎病具有较好防效的内生细菌，其温室的平均防治效果为62.57%，温室防效较为稳定，经鉴定此细菌为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，此细菌对棉花生长无毒负作用，对人畜、昆虫和作物安全，环境友好，具有较大的开发为生物制剂的潜在性。

2、生防菌株HB3S-20（恶臭假单胞菌Pseudomonas putida）对棉花的出苗率和棉花生长没有负面影响：菌株HB3S-20菌液浸泡种子14h后的棉株的出苗率为74.67%，对照组清水处理后种子的出苗率为75.5%，说明其对种子出苗率的影响小。与对照相比，菌株HB3S-20菌液处理种子20d后棉株的根长与对照相比没有显著差异，但棉株的株高和鲜重有显著差异，说明菌株HB3S-20对棉花的生长具有一定的促生作用。

3、菌株HB3S-20是一株从棉花的茎部分离出来的细菌，能够在人工培养基上生长和繁殖，且生长和繁殖速度快，有利于大量繁殖和推广应用。

附图说明

图1 是菌株HB3S-20在NA培养基上的菌落形态。

图2是菌株HB3S-20与黄萎病菌的对峙培养结果图。

图3是菌株HB3S-20对黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用图（左图为处理，右图为对照）。

图4为黄萎病菌V991孢子液与菌株HB3S-20细菌菌液混合接种后30d的棉苗发病情况图。

图5为仅接种黄萎病菌V991孢子液后30d的棉苗发病情况图。

具体实施方式

（1）将内生细菌HB3S-20在NA培养基上划线，置于28℃ 培养箱中培养，生长良好，在NA培养基上的菌落形态为淡黄色，菌落为圆形，菌体不透明，有凸起，革兰氏染色为革兰氏阴性细菌，结果见图1。

（2）内生细菌HB3S-20与黄萎病菌的对峙培养作用

将黄萎病菌菌株V991的菌饼接种在PDA平板的中央， 置于25℃培养3d后，分别吸取10µl菌株HB3S-20菌液（摇培 24h）置于离菌落边缘2cm处的四个角，以无菌水作为对照。置于25℃培养生长7d后，分别量取与菌株HB3S-20对峙培养后黄萎病菌的菌落直径大小和对照的菌落直径大小，并计算HB3S-20对黄萎病菌生长的抑制率，结果见图2，抑菌率的公式如下：

抑菌率=（对照的菌落直径大小-处理后的菌落直径大小）/对照的菌落直径大小×100%。

（3）菌株HB3S-20对棉花黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用

将2ml浓度为1×10⁷个/ml的黄萎病菌孢子液加入到冷却至50~55℃左右的200mlPDA培养基中并混匀，使其终浓度为1×10⁵个/ml，倒入到90mm培养皿中，待冷却后用6mm打孔器打孔将相应的培养基圆块取出，将20µl HB3S-20菌液加入到PDA平板中已被6mm打孔器处理后的空孔中，以将无菌水加入到空孔中作为对照，2d后观察黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长情况，结果见图3。

（4）HB3S-20对棉花黄萎病的温室防效的验证

将脱绒的冀11棉花种子用60℃的温开水浸泡12h,种入营养基质中，待棉苗长至2片真叶，将棉苗移栽出营养基质进行接种处理。将黄萎病菌菌株V991活化后，接入到查氏培养基，25℃，180rpm摇菌7d,用四层纱布过滤获得孢子液，调整浓度至1×10⁷个/ml，待接种用。对保存在-80℃的HB3S-20菌株进行活化，挑单菌落于装有3 mlNB培养基的试管中培养过夜，然后加1ml的培养液到含50 mlNB培养基的200 ml锥形瓶中，28℃，180rpm摇菌3d，将摇培后的内生菌菌液用50ml离心管6000rpm离心10min,去掉上清，将沉淀用无菌水溶解，调整浓度至1×10⁸个/ml，即为内生菌菌液。

将大丽轮枝菌孢子液与内生菌菌液等体积混合接种棉苗的根部即浸根处理20min，每个处理15株棉苗，以仅用大丽轮枝菌孢子液处理棉苗为阳性对照，以无菌水处理为阴性对照。然后移栽到一次性塑料钵中，每个钵中3株，温室温度保持在25-30℃，并隔天浇一次水，保持一个合适的湿度。实验重复3次。

采取接种后15d开始调查，每5d调查一次，即接种后15d、20d、25d、30d分别调查病指。按5级标准记载发病严重度并计算病情指数。用公式计算病情指数，棉苗发病率和防效，结果见图4、图5及表1。

（5）HB3S-20在棉株体内的定殖

用300µg /ml Rifampicin对HB3S-20进行筛选获得抗性菌株，挑单菌落入试管中摇菌过夜，将菌液接入50ml的NA培养基中摇菌48h,调整菌液浓度至1×10⁸个/ml后，对健康的2叶期棉花根部进行浸根20min,分别在接种后1d、3d、5d、7d、9d和11d取植株，用自来水反复冲洗植株的茎部和根部，吸干水分，取部分根部和茎部称重，用70%酒精表面消毒1.5min,用无菌水清洗5遍，用灭菌枪头将组织碾碎，加500µl无菌水混匀，取50µl均匀涂布在含300µg /ml Rifampicin的NA培养基上。于28℃培养3d后观察抗性菌株的分离情况并计算抗性菌株的数量。

结果表明从各个处理组棉株的根部和茎部均能够分离得到抗性菌株(对照并不能分离到)，说明HB3S-20能够很好的定殖在棉花的根部和茎部。

（6）菌株HB3S-20对棉花出苗率和棉花生长的影响

棉花感病品种冀11的种子脱绒后，在HB3S-20菌液中浸泡14h后种入营养基质中，3d后计算其出苗率，以无菌水浸泡种子作为对照。20d后统计15株棉苗的株高、根长和鲜重，结果见表2。

（7）菌株HB3S-20的biolog鉴定

通过对菌株HB3S-20进行biolog鉴定，比对软件分析结果表明菌株HB3S-20与参考菌株恶臭假单胞菌(P．putida)的相似性最高为82％。

（8）HB3S-20的16s rRNA分子鉴定

用细菌16s rRNA序列（见序列表）的通用引物（引物序列： F 5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’， R 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’）对菌株DNA进行PCR扩增,PCR反应条件如下： 95 ℃预变性3min,94 ℃变性30s,53℃退火45s,72 ℃延伸1.5min,35个循环，72℃延伸10 min.扩增产物进行纯化和测序，测序结果与NCBI上的序列进行比对后发现，其与假单胞菌属中的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的16s rRNA序列的同源性达到99%，推断其为Pseudomonas putida。假单胞菌属是一种广泛存在于土壤和植物体内较为常见的细菌。

<110>湖北省农科院植保土肥所

<120>内生细菌HB3S-20及在棉花黄萎病防治中的应用

<160>3

<210>1

<211>1400

<212>DNA

<213>恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida HB3S-20）

<400>1

tgcgagtcga gcggatgacg ggagcttgct ccttgattca gcggcggacg ggtgagtaat 60

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<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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