一种新的H5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法与流程

本发明属于卵黄抗体监测技术领域，具体涉及一种新的H5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法。

背景技术：

H5亚型禽流感属于高致病性禽流感，是最严重的家禽传染病之一，可造成养禽业(包括鸡、鸭、鸽、鹌鹑等)的重大经济损失，免疫接种是我国最主要的防控措施，免疫产生的抗体效价高低直接决定着免疫质量和防控成败。由于免疫接种容易受到多种因素的影响，如疫苗因素、动物因素、饲养管理因素、疾病因素等，而且动物的免疫反应看不到、摸不着，所以免疫质量存在很大的不确定性，这给防控带来极大的困难。抗体监测是检验免疫质量最直接、最有效的方法，通过抗体监测可以确定科学的免疫程序、合理的免疫时间，选择优质的疫苗、准确的免疫剂量，从而确保免疫效果。抗体监测还可以提示H5亚型禽流感发生的风险，如果抗体效价低于4log2，鸡群的抗体不足以抵抗病毒的侵袭，发病的风险增大，定期进行H5亚型禽流感抗体监测可以评估疫苗免疫质量和预警疫病的发生，是预防控制H5亚型禽流感的重要措施。

抗体监测是利用免疫学试验的原理，用已知抗原检测相应特异性抗体的方法，其在免疫质量评估、疫病诊断、疫病监测、疫情预警、疫病控制等方面发挥重要作用，是动物疫病防控的主要技术手段。抗体监测主要以血清抗体效价为标准，利用血清学试验检测血清抗体，常用的方法有血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，其中HA和HI是禽流感抗体监测的最常用方法。血清抗体监测具有结果准确、可靠的优点，但同时具有操作繁琐、影响鸡健康和生产性能的缺点。因为需要采血和分离血清，操作过程繁琐，浪费人力和时间，同时采血引起的应激会给养鸡生产造成不良影响，从而导致血清抗体监测在实践应用中受到一定的限制。然而，与血清制备相比，卵黄制备更加简便和安全，只需要收集鸡蛋，不需要采血，所以用卵黄代替血清进行抗体监测具有一定的优势和推广价值，我国早在20世纪80年代就有用卵黄抗体代替血清抗体进行新城疫抗体监测的报道。

卵黄抗体(IgY)是禽类在抗原刺激下产生的沉积于卵黄中的针对特定抗原的抗体，是禽类在长期进化过程中形成的用于提高雏禽抵抗力的物质。当家禽受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环；当血液流经卵巢时，特异性抗体选择性地(主要是IgG)转移并沉积到卵黄，形成卵黄抗体；IgG在卵细胞中具有蓄积作用，所以卵黄抗体的浓度高于血清中的抗体浓度。自1893年KIemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来，人们对卵黄抗体的认识不断加深，相关研究也愈来愈受到关注，其中用卵黄抗体代替血清抗体进行抗体监测是其中内容之一。当前用于检测禽流感卵黄抗体的方法有多种，如氯仿提取法、生理盐水提取法、磷酸盐缓冲液提取法等，其中氯仿提取法使用最多。虽然氯仿提取法是最接近血清抗体的方法，但是结果仍然存在准确性和稳定性的问题，这是卵黄抗体代替血清抗体进行禽流感抗体监测最大的难题。卵黄抗体监测虽然具有操作简便、安全的优点，但同时具有结果不准确、不可靠的缺点。

卵黄抗体是指禽类经免疫后卵黄内含有的特异性抗体；血清抗体是禽类经免疫后血清内含有的特异性抗体；血凝抑制试验是指某些具有凝集红细胞能力的病毒(或抗原)能被相应抗体抑制，原理是相应抗体与病毒(或抗原)结合后，阻止病毒(或抗原)表面血凝素与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒的诊断和抗体监测；抗体监测是通过免疫学实验的方法，即用已知抗原检测被检样品中有无相应的特异性抗体，其主要作用是检验免疫性与免疫效果，对于抗体监测中发现免疫效果不好则可提示需要加强免疫或调整免疫程序，是动物疫病预防控制工作中重要的技术手段，具备重要的参考价值，并非疾病的诊断与治疗方法。

在禽类疫病的抗体监测中，血清抗体检测结果可靠众所周知，但是血清抗体监测需要采血，在生产中有一定的技术难度，还会产生应激，影响家禽的健康和生产性能；卵黄抗体检测不需要采血，只需要提供禽蛋，不会产生应激，不会影响家禽的健康和生产性能。新城疫和禽流感病毒的抗体监测一直以血清抗体效价为标准，而卵黄抗体效价与血清抗体效价存在一定的差距，致使卵黄抗体检测在生产中得不到认可。近年来产生了很多希望以卵黄抗体监测替代血清抗体监测的方法，但是卵黄抗体的情况与血清抗体有一定差距，之间的关联性难以保证，往往导致监测结果不可靠。现有技术有很多对于两者之间的关联性进行了分析，但是结果往往仅仅局限于测得效价的数值对比，试图从中总结出简单的数值规律来，以意图使得卵黄抗体的监测能够代替血清抗体，但这是不足取信的。卵黄抗体的效价的确定是卵黄代替血清的最关键点，相较于血清抗体的效价确定技术非常成熟，卵黄抗体存在于卵黄中，也存在于蛋清中，又属于非均相液态物混合，现有的技术中很难保证卵黄中的所有抗体均参与了抗体监测实验，根据实际采取方法的不同，往往不是少引入了，就是将抗体误算至更多了，单一方法很难保证所得的卵黄抗体效价的可信性。

技术实现要素：

申请人通过实验发现，针对卵黄进行H5亚型禽流感抗体效价监测，用氯仿处理一般效价偏低，而用水处理一般效价偏高，申请人认为其基于以下的机理：

卵黄中含有水分约48.0％、蛋白质约17.8％和脂肪约30.5％,其中大部分蛋白质与脂肪结合以脂蛋白的形式存在，其中包括卵黄抗体。正因为卵黄抗体不易简单分离，所以在实际测定中很难测准卵黄抗体效价。

对于常用的氯仿法提取测效价，氯仿能够溶解卵黄中的脂肪，用它处理的卵黄经离心后分为3层，最下层淡黄色，为氯仿层；中间层为凝固的脂肪层；最上层澄清透明，为提纯的卵黄抗体溶液。处理过程中，会丢失部分卵黄抗体，丢失在脂肪层或者是氯仿层中溶解的脂肪中，所以会导致血凝抑制抗体效价偏低。

而另一种处理路线，水溶性处理液，如生理盐水、枸橼酸钠溶液、磷酸盐缓冲液等，处理卵黄主要起到单纯的稀释作用，于是，在实际测定中，除抗体和抗原发生特异性结合以外，卵黄其它成份也和抗原发生了非异性结合，所以会导致血凝抑制抗体效价测定值偏高。

而现有技术中，针对血清抗体效价的监测一般比较准确，因为血清中抗体的分离技术成熟，准确，可重现性强，但用卵黄抗体监测虽然样本收集简单，不影响禽只的优点，但有测定结果不准确的缺点，不克服这一缺点是很难替代血清抗体监测的。

本发明因此想到了将氯仿处理的卵黄提取液与磷酸盐缓冲液处理的卵黄提取液合并，由此抵冲两者分别偏高和偏低的技术偏差，从而得到比较可靠的卵黄抗体效价，抗体效价再经修订可以更接近血清的抗体效价。抗体监测在防控中具有重要作用，在生产中将得到越来越多的应用，本发明是对应采集商品蛋鸡的血液和鸡蛋，分别检测血清、磷酸盐缓冲液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液的H5亚型禽流感血凝抑制抗体效价，在磷酸盐缓冲液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液效价数值相对于血清抗体偏离方向客观分析的基础上，建立一种卵黄抗体代替血清抗体进行抗体监测的方法，解决了卵黄抗体结果不准确、不可靠的问题。本发明的方法操作简便、安全，结果准确、可靠，可以用卵黄取代血清进行蛋禽、种禽的H5亚型禽流感抗体禽流感病毒抗体监测，避免了采血的麻烦和影响，易于推广和应用。

本发明的方法是基于这样的客观情况的分析，即使得两种常用方法处理卵黄以监测效价的方法予以互补，这里指的是用氯仿和用磷酸盐缓冲液。

本发明提供一种利用卵黄样本代替血清样本，利用磷酸盐缓冲液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液进行H5亚型禽流感抗体监测代替血清抗体监测的方法。其特征在于，抗体监测过程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不会对家禽产生应激，不会影响家禽的健康和生产性能；抗体监测过程中用两种卵黄提取液的混合液抗体效价经进一步修订值代替血清抗体效价，主要用于蛋禽和种禽的H5亚型禽流感抗体监测，也可用于评估雏禽禽H5亚型禽流感抗体水平以确定首免时间。

本发明的有益效果是：以禽蛋作为检测样品，用磷酸盐缓冲液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液，两种提取液进行等量混合，进行混合液的H5亚型禽流感抗体效价测定，经适当修订后代替血清抗体效价。修订系数为0～1，是受疫苗种类、免疫时期、免疫程序等因素影响。通过该方法，抗体监测操作更简便、更安全，结果更准确、更可靠，大大提高H5亚型禽流感抗体监测在生产中的适用性。

本发明要求保护一种新的检测卵黄中H5亚型禽流感抗体的方法，其特征在于：

1)卵黄原料采集步骤

鸡蛋采集是在养禽场中随机采集鸡蛋20枚或以上，保证采集的鸡蛋来自整个鸡群的分散度；将禽蛋用镊子在壳上轻轻敲开直径约1cm的小洞，撕开壳膜将蛋清完全倒出，再打开蛋壳将蛋黄完整倒入培养皿，进而挑开卵黄囊，用注射器直接避开表面蛋清抽取卵黄，将抽取到的卵黄注入到小烧杯中，玻棒搅匀使全部提取卵黄充分混匀，备用。

2)卵黄抗体提取

A、磷酸盐缓冲液提取卵黄中抗体

吸取2ml提取卵黄加入离心管中，再加入2ml磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，室温放置1h，得到浑浊的卵黄抗体提取液A，备用。

B、氯仿提取卵黄中抗体

吸取2ml提取卵黄加入离心管中，加入2ml磷酸盐缓冲液，混合后加入4ml氯仿，充分振荡混匀，室温放置1h，期间搅拌混匀3次，再通过3000r/min离心10min，出现分层，上层为卵黄抗体提取液B，分离备用。

3)两种提取方式卵黄液的混合

将步骤2所得到的卵黄抗体提取液A与B按等量比例混合得混合液，即为监测用卵黄抗体样本。

4)血凝试验

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍数稀释的抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25μL；设立第12列孔为红细胞对照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％鸡红细胞悬液25μl；立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀1min；在室温下作用30min，或在4℃下作用60min；观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀为一个圆点，将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果；血凝效价高于211时可继续增加稀释的孔数，以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，此时血凝效价为2n，n>11，再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位；并根据测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原的稀释倍数，制备4个血凝单位抗原。

5)血凝抑制试验与效价确认

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS。

将步骤3的混合液，取体积25μl于第1列孔，混匀后由左向右顺序倍比稀释至第11列孔，最后弃去25μl；第1列孔至第12列孔分别加25μl含4个血凝单位的抗原；立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀1min；在室温下作用30min，或在4℃下作用60min；每孔加0.75％鸡红细胞悬液25μl；混合后置室温下作用40min或在4℃下作用60min，此时对照的红细胞已沉淀为一个圆点；血凝抑制效价高于211时可继续增加稀释的孔数，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该混合液的血凝抑制效价，测定抗体效价加上修订系数即为卵黄抗体替代血清抗体的血凝抑制效价。

6)主要试剂及配制

PBS：

配制20倍PB：称量5.157g Na2HPO4.12H2O和0.874g NaH2PO4.2H2O，加蒸馏水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000ml；用NaOH或HCl调pH值至7.2；121℃高压蒸汽灭菌15min。

0.75％鸡红细胞悬液：

采集至少3只SPF公鸡或无H5亚型禽流感抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用前述PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心5-10min，洗涤后用前述PBS配成0.75％红细胞悬液，4℃保存备用，所述0.75％为体积比。

前述的制备方法，其特征在于：

其中所述抗原是H5亚型禽流感抗原；

前述的步骤3中的按等量比例，是卵黄抗体提取液A：50％，卵黄抗体提取液B：50％；

前述的制备方法，其中的鸡红细胞悬液可以现配即用，也可以利用红细胞保存液制备，该红细胞保存阿氏液配制方法：称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，溶解后调pH值至6.1，115℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。

附图说明

图1是本发明提供的替代H5亚型禽流感血清抗体监测的卵黄抗体混合液的制备方法的流程图。

图2是本发明提供的替代H5亚型禽流感血清抗体监测的卵黄抗体样品的计算方法的流程图。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例

1)卵黄原料采集步骤

鸡蛋采集是在蛋鸡场中随机采集鸡蛋24枚，保证采集的鸡蛋来自整个鸡群的分散度；将禽蛋用镊子在壳上轻轻敲开直径约1cm的小洞，撕开壳膜将蛋清完全倒出，再打开蛋壳将蛋黄完整倒入培养皿，进而挑开卵黄囊，用注射器直接避开表面蛋清抽取卵黄，将抽取到的卵黄注入到小烧杯中，玻棒搅匀使全部提取卵黄充分混匀，备用。

2)卵黄抗体提取

A、磷酸盐缓冲液提取卵黄中抗体

充分搅拌吸取2ml提取卵黄加入离心管中，再加入2ml磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，室温放置1h，得到浑浊的卵黄抗体提取液A，备用。

B、氯仿提取卵黄中抗体

吸取2ml提取卵黄加入离心管中，加入2ml磷酸盐缓冲液，混合后加入4ml氯仿，充分振荡混匀，室温放置1h，期间搅拌混匀3次，再通过3000r/min离心10min，出现分层，上层为卵黄抗体提取液B，分离备用。

3)两种提取方式卵黄液的混合

将步骤2所得到的卵黄抗体提取液A与B按等量比例混合得混合液，即为监测用卵黄抗体样本。

4)血凝试验

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍数稀释的禽流感抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25μL；设立第12列孔为红细胞对照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％鸡红细胞悬液25μl；立即置微型振荡器上混合1min；在室温下作用30min；观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀为一个圆点，将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果。根据测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原的稀释倍数，制备4个血凝单位抗原。H5亚型禽流感(Re-7)血凝效价为210，4血凝单位抗原为28稀释。

5)血凝抑制试验与效价确认

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS。

将步骤3的混合液，取体积25μl于第1列孔，混匀后由左向右顺序倍比稀释至第11列孔，最后弃去25μl；第1列孔至第12列孔分别加25μl含4个血凝单位的禽流感抗原；立即置微型振荡器上混合1min；在室温下作用30min；每孔加0.75％鸡红细胞悬液25μl；混合后置室温下作用40min，此时对照的红细胞已沉淀为一个圆点；以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该混合液的血凝抑制效价，测定抗体效价加上修订系数0.8即为H5亚型禽流感卵黄抗体替代血清抗体的血凝抑制效价。为了证实本发明方法的有效性，特将实测单用氯仿法以及单用磷酸缓冲液提取测定的卵黄数值与本发明数值产生的结果进行简单比较。列表如下：

表1 H5亚型禽流感(Re-7)3种卵黄抗体效价及对应血清抗体效价结果(以log2表示)

表1为H5亚型禽流感的卵黄抗体及对应血清抗体结果，磷酸盐缓冲液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液抗体效价与血清抗体效价偏差较大，符合度较低，而磷酸盐缓冲液、氯仿提取卵黄液的等量混合液抗体效价加上修订系数与血清抗体效价偏差较小，符合度较高，明显优于磷酸盐缓冲液提取卵黄液抗体效价或氯仿提取卵黄液抗体效价，其效价值比较接近血清效价测算结果，而其操作起来又没有血清效价检测的仪器要求和繁琐步骤，是一种可信度较高的，可在一定程度上代替H5亚型禽流感血清抗体监测的方法。

6)主要试剂及配制

PBS：

配制20倍PB：称量5.157g Na2HPO4.12H2O和0.874g NaH2PO4.2H2O，加蒸馏水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000ml；用NaOH或HCl调pH值至7.2；121℃高压蒸汽灭菌15min。

0.75％鸡红细胞悬液：

采集3只无H5亚型禽流感抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用前述PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用前述PBS配成0.75％红细胞悬液，4℃保存备用，所述0.75％均为体积比。

步骤3中的按等量比例，是卵黄抗体提取液A：50％，卵黄抗体提取液B：50％。

前述的制备方法，其中的阿氏液配方为：

红细胞保存阿氏液：称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，溶解后调pH值至6.1，115℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。

本发明在实际测定中的注意事项：

(1)试验所用抗原的效价一定得标定准确，每次监测之前一定先准确测定抗原的效价，应该是同时测2～3遍取其平均值，然后根据其准确效价配制所需抗原液(4单位抗原)。抗原液配制好后，要自测一次，即在不加血清的情况下，第1、第2孔的血球完全凝集，第3孔部分凝集(血球在孔壁凝成一红圈而不是均匀的凝集)，说明4单位抗原的配制没有问题，可以使用。

(2)红细胞应采自没有免疫过的成熟公鸡，未成熟的公鸡红细胞较脆弱，易溶血，不能用。红细胞经过反复离心洗涤后配成0.75％为更好，实践证明，1％的红细胞都不如0.75％的好。红细胞悬浮液最好是现配现用，存放时间过长红细胞发生破裂，会影响试验结果。

(3)修订系数通常为0～1，实施例中确定为0.8，修订系数与疫苗、免疫时期、免疫程序等有关，需要根据经验确定，可靠的修订系数可进一步提高抗体效价的准确性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明所涉及的组成成分和制备方法均可根据实施方式进行相应调整，但不能超出该发明保护范围。