蛋白StTrxF、编码基因及其在提高植物淀粉含量中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中与马铃薯淀粉合成相关的蛋白StTrxF及其编码基因与应用。

背景技术：

随着中国社会经济的快速发展和随之而来的汽车保有量的增加，石油消费快速递增，进口依赖度日益增加，已经对我国能源安全和经济发展形成了巨大影响和制约。发展石油的替代燃料已成当务之急，其中燃料乙醇是目前世界上使用量最大、最现实可行的替代石油的生物燃料。加工燃料乙醇的原料包括淀粉类的玉米、薯类等，糖类的甘蔗、甜菜等以及纤维素类的秸秆等。

马铃薯是世界上主要作物之一，继小麦、玉米和水稻之后排在第四位。马铃薯产量高、适应性强，用途十分广泛，是很好的加工原料，也是世界上最有发展前景的高产经济作物之一。马铃薯主要收获物为地下膨大的块茎，富含淀粉、蛋白质、脂肪、粗纤维和多种维生素、矿物质，营养丰富，用途广泛，主要供食用，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。近年来，中国马铃薯生产发展较快，栽培面积和总产量均有较大幅度提高，已跃居世界第1位，在保障我国粮食安全、促进农民增收和发展民族工业等方面已发挥了一定作用。

淀粉是植物通过光合作用产生的一种多糖高分子化合物，淀粉生物合成过程中有四种关键酶，即：腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGpase)、淀粉合成酶(starch synthase)，分支酶(branching enzyme)及去分支酶(de-branching enzyme)。在AGPase的作用下，葡萄糖-1-磷酸(Glu-1-P)与ATP作用生成ADP-葡萄糖(ADP-Glu)，随后ADP-Glu合成具有一定结构特性的淀粉结晶体。AGPase是淀粉合成过程中的限速酶，催化淀粉合成的第一步，其活性的改变将直接影响着淀粉的合成速率，直接决定贮藏组织中淀粉积累的水平。

硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是一类广泛存在于生物体内的多功能活性蛋白，分子量约为12kDa，含有一个氧化还原活性的二硫键，可通过还原靶蛋白中的二硫键参与细胞包括酶活性的调节(Holmgren 1989；Arnér和Holmgren 2000)、转录因子的调控(Schenk等1994；Hirota等1999；Chae等1994)等在内的一系列生化反应。

技术实现要素：

技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了蛋白StTrxF、编码基因，还提供了上述蛋白和编码基因在提高植物淀粉含量中的应用。

技术方案：本发明所提供了与淀粉合成相关的蛋白，名称为StTrxF，来源于马铃薯(Solanum tuberosum)，是如下(a)或(b)的蛋白质

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物组织中淀粉含量相关的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码蛋白StTrxF的基因。

所述基因，与碳氮代谢相关蛋白，为如下(1)-(3)中任一所述的基因：

(1)其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物组织中淀粉含量相关蛋

白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码植物组织中淀粉含量相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列SEQ ID NO：1由549个碱基组成，编码序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本发明还提供了含有所述与淀粉合成相关蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组载体为将上述基因插入表达载体中即得。

具体地，所述重组载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入上述编码基因得到的。

其中，所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI 121载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，即得载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI 121载体购自Clontech公司。

本发明还提供了上述扩增与淀粉合成相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对。

具体地，所述引物对序列如下：

StTrxF-GC-F：5’-AATAGCAAAAATGGCGTTACAAGT-3’

StTrxF-GC-R：5’-TTTAACTTGATCGCACACCCTC-3’

本发明还提供了蛋白StTrxF、其编码基因或其重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在调节植物组织中淀粉含量中的应用；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，即得。

具体地，权利要求1所述蛋白的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物优选拟南芥。

有益效果：本发明所提供的StTrxF基因所编码的蛋白可大大提高AGPase和可溶性淀粉合酶的活性，该基因的表达也可以提高淀粉的生物合成。

本发明所提供的StTrxF蛋白及其编码基因在提高淀粉含量上具有重要的应用价值，为提高马铃薯淀粉含量的研究提供重要的依据，将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

本发明的实验证明，本发明提供的StTrxF蛋白及其编码基因，将该基因导入野生型拟南芥中，得到转基因拟南芥植株。研究发现，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥叶片中的淀粉含量显著提高，说明该蛋白及其编码基因在提高拟南芥叶片中的淀粉含量中具有重要的应用价值，将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为马铃薯StTrxF基因植物表达载体图。

图2为StTrxF转基因拟南芥植株的PCR检测结果图。

图3为葡萄糖标准曲线。

图4为StTrxF转基因拟南芥植株叶片中淀粉含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

马铃薯(Solanum tuberosum)品种中薯5号由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)的种子经过2.5％(v/v)CaClO₂消毒后种植在黑土：蛭石：珍珠岩(1:1:1)的混合基质中，22℃，16h光照培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长2周。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》(Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行(Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。

实施例1 马铃薯淀粉合成相关的蛋白及其编码基因的获得

1.实验材料

将马铃薯品种中薯5号无菌苗展开叶叶片取下，液氮速冻，-80℃保存。

2.叶片总RNA提取和纯化

取中薯5号无菌苗展开叶叶片约2.0g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取的中薯5号无菌苗叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于马铃薯StTrxF蛋白cDNA全长的克隆。

3.StTrxF蛋白cDNA的全长克隆

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的StTrxF的cDNA序列设计引物进行StTrxF蛋白cDNA的全长克隆。

引物序列如下：

StTrxF-GC-F：5’-AATAGCAAAAATGGCGTTACAAGT-3’

StTrxF-GC-R：5’-TTTAACTTGATCGCACACCCTC-3’

以中薯5号叶片总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃1min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得549bp长度的扩增片段。

综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO：1所示。序列表中序列SEQ ID NO：1由549个碱基组成，自5’端第1位-第549位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO：2由182个氨基酸残基组成。将该基因命名为StTrxF，将其编码的蛋白命名为StTrxF。

实施例2 StTrxF基因过表达载体的构建

将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T₄DNA连接酶将回收的StTrxF基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有马铃薯StTrxF基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。

实施例3 StTrxF基因转化拟南芥

将实施例2构建的马铃薯StTrxF基因的植物表达载体pCAMBIA1301-StTrxF用蘸花法转化拟南芥，具体方法如下：

1.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-StTrxF用电击法转化根癌农杆菌LBA4404菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-StTrxF的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。

(3)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化

(1)将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22℃避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。

(2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

(3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

实施例4 StTrxF基因转基因拟南芥植株PCR检测

1.转基因拟南芥种子的筛选

(1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管；

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清；

(3)加入1mL过滤后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5s，去上清；

(4)无菌水洗涤3-4次；

(5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养10天。

(6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₁)培养至开花结实，收集T₁植株上所结T₂种子，进一步筛选得到T₃种子。

2.转基因拟南芥植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取转基因植株和对照植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的StTrxF基因引物为：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图2(图2中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-StTrxF)；泳道WT：野生型拟南芥植株；泳道VC：转空载体拟南芥植株；泳道L1、L2：为转化pCAMBIA1301-StTrxF的拟南芥转基因植株)。从图中可见，转化pCAMBIA1301-StTrxF的拟南芥拟转基因植株和阳性对照扩增出591bp的目标条带，表明StTrxF基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型拟南芥植株没有扩增出591bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例5 StTrxF基因转基因拟南芥植株的淀粉含量测定

淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的显色反应，即可进行可溶性淀粉含量测定。叶片可溶性淀粉含量测定方法参照陈秀兰【蒽酮比色法测定木薯块根的淀粉.分析化学,1984,(4):319】，略有改动。

具体方法如下：

(1)工作曲线绘制

首先取6个洁净的试管，编号CK、1、2、3、4和5，按照表1所示溶液配方，加入相对应编号的试管中，再用蒸馏水分别定容至体积为2.0mL。从滴定管中分别向5个试管中加入蒽酮试剂6.0mL。摇匀并立即置于沸水浴中加热5min，取出立即在冷水中迅速冷却(不断摇动)。用分光光度计测定640nm波长的OD值。以OD值为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准工作曲线(图3)。

表1葡萄糖标准曲线绘制溶液配制

(2)样品的提取

分别将编号为L1、L2的T₃代转StTrxF拟南芥、野生型拟南芥和转空载体拟南芥叶片烘干磨碎后，称取0.10g放入研钵中，加入5mL蒸馏水磨至均匀全部移入离心管中，3000r/min离心5min。离心液倒入干净试管中，再向盛有沉淀的离心管加5mL蒸馏水并搅拌沉淀物，进行第二次离心。然后加入10mL 3mol/L盐酸将离心管中沉淀物全部转移到容量瓶中，盖上瓶塞，放在沸水浴中煮沸40～45min，取出冷却至室温，加3mol/L氢氧化钠溶液10mL中和其酸性，最后用蒸馏水定容至50mL，从中取2mL溶液，加蒸馏水至50mL，混匀，得到样品测定液，用于淀粉含量的测定。

(3)淀粉测定

取上述制备好的样品测定液2mL，加入6mL蒽酮试剂，摇匀，放在沸水浴中煮沸5min，取出，立即放入在冷水中冷却至室温，在640nm下测定OD值，查葡萄糖标准曲线并计算淀粉百分含量。

淀粉百分含量计算公式如下：

式中：

Y──查标准曲线得淀粉水解稀释测定液糖量(μg)

V₀──水解液总体积(mL)

V₁──水解稀释液体积(mL)

V₂──用于稀释的样品液体积(mL)

V₃──用于比色时样品稀释液体积(mL)

m──样品称重(g)

0.9──换算糖为淀粉量

编号为L1、L2的T₃代转StTrxF拟南芥、野生型拟南芥和转空载体拟南芥叶片淀粉含量测定结果如图4所示，图4中编号L1、L2分别表示2个转基因拟南芥植株的待测样品；VC表示野生型拟南芥植株的待测样品；WT表示转空载体拟南芥植株的待测样品。mg/g·DW表示每克干重样品所含的可溶性淀粉含量的毫克数。

图4中可知，转空载体拟南芥和野生型拟南芥的淀粉含量无显著差异。

图4中可知，L1、L2的T₃代转StTrxF拟南芥叶片的淀粉含量与野生型拟南芥相比有一定程度的提高，分别提高了66.39％和86.55％，说明导入StTrxF基因可以显著提高转基因植株的淀粉含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮阴工学院

<120> 蛋白StTrxF、编码基因及其在提高植物淀粉含量中的应用

<130> 20161118

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(549)

<400> 1

atggcgttac aagttcaagt aaatcaggta ctattgaagt catcagtggc gccgacgccg 60

gcgcagtcgg catcttctcc gtggaggttc aacaatcagt cagtggtatg cgttgcagga 120

gattatggct tctcgtctag ggttttgagg agcagaggat tgagcttgaa ggtgaagtgt 180

agtagctcag atgctactgt tactactacg actgtgacgg taggacaggt gacggaagtt 240

tgtaaggata ccttttggcc gattgttgaa gccgccggtg aaaaaactgt cgtagttgac 300

atgtatacac agtggtgtgg tccttgtaaa gtgatcgctc caaagtttca agagctatcg 360

aagaaatata atgatgtggt ctttctgaag ctggactgta accaggacaa caggccatta 420

gcgaaggaac taggcataaa ggtggttccg acattcaaga ttctgaagaa caataagatc 480

gttaaagaag tcactggagc aaaacttgat gatttagtag cagcaattga gggtgtgcga 540

tcaagttaa 549

<210> 2

<211> 1

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(182)

<400> 2

Met Ala Leu Gln Val Gln Val Asn Gln Val Leu Leu Lys Ser Ser Val Ala Pro Thr Pro

1 5 10 15 20

Ala Gln Ser Ala Ser Ser Pro Trp Arg Phe Asn Asn Gln Ser Val Val Cys Val Ala Gly

25 30 35 40

Asp Tyr Gly Phe Ser Ser Arg Val Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Leu Lys Val Lys Cys

45 50 55 60

Ser Ser Ser Asp Ala Thr Val Thr Thr Thr Thr Val Thr Val Gly Gln Val Thr Glu Val

65 70 75 80

Cys Lys Asp Thr Phe Trp Pro Ile Val Glu Ala Ala Gly Glu Lys Thr Val Val Val Asp

85 90 95 100

Met Tyr Thr Gln Trp Cys Gly Pro Cys Lys Val Ile Ala Pro Lys Phe Gln Glu Leu Ser

105 110 115 120

Lys Lys Tyr Asn Asp Val Val Phe Leu Lys Leu Asp Cys Asn Gln Asp Asn Arg Pro Leu

125 130 135 140

Ala Lys Glu Leu Gly Ile Lys Val Val Pro Thr Phe Lys Ile Leu Lys Asn Asn Lys Ile

145 150 155 160

Val Lys Glu Val Thr Gly Ala Lys Leu Asp Asp Leu Val Ala Ala Ile Glu Gly Val Arg

165 170 175 180

Ser Ser

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> StTrxF-GC-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<400> 3

aatagcaaaa atggcgttac aagt 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> StTrxF-GC-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 4

tttaacttga tcgcacaccc tc 22