本发明涉及一种提取纯化贯叶金丝桃素的方法。
背景技术：
贯叶金丝桃素(Hyperforin)主要存在于金丝桃属贯叶连翘Hypericum perforatum L.及同属其它植物中,该化合物具有抗抑郁和抗菌作用。Muller等证明贯叶金丝桃素在纳摩尔浓度(10-9mol/L)水平不但能抑制5-HT、NE、DA的再摄取，而且还能诱导皮质β-肾上腺素受体表达的负调控。Muller的研究表明，贯叶金丝桃素同传统的5－HT、NE抑制剂一样，能够抑制所有三种单胺的再摄取。Bhattacharya等研究表明，贯叶金丝桃素与抗抑郁药及抗焦虑药在动物抑郁的实验模型中的活性类似，贯叶金丝桃素能提高在强迫游泳实验和非帮助学习实验中动物抗抑郁的能力。含贯叶金丝桃素的提取物或其衍生物可作为抗抑郁的药品、功能食品或普通食品的开发。
贯叶金丝桃素，分子量536.77，熔点79-80℃，对光、热和空气不稳定，易氧化,贯叶金丝桃素(hyperforin)的结构式如下：
已有的贯叶金丝桃素的提取方法，最常用的是取粉碎的干燥全草，用有机溶剂乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚等浸提，提取物含量一般不超过2％。另有采用贯叶连翘的花进行提取，所得提取物中贯叶金丝桃素含量达到4-7％，但贯叶连翘的花难以大量得到。
中国专利公开号CN1176893C中，采用极性溶剂(醇类、酮类、酮水混合溶剂或酮醇水以任意比例的混合溶剂)提取，提取液减压浓缩后用非极性溶剂(石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类)两相萃取；或采用非极性有机溶剂(石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类)提取，所得提取液经40-60％乙醇除杂，非极性溶剂相用pH≥8.5的含碱的40-60％乙醇水溶液萃取，取碱醇相，碱醇相调至pH＝0-4后，再用非极性有机溶剂萃取1-3次，取非极性溶剂相减压浓缩，得到贯叶金丝桃素类成分含量不低于65％的提取物。将所得到的贯叶金丝桃素含量不低于65％的提取物进行硅胶柱层析，洗脱液为石油醚等非极性溶剂，回收溶剂。将回收溶剂后的组分用2倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离纯化，柱填料为C18，检测波长为270nm，洗脱液经石油醚等非极性溶剂萃取，取非极性溶剂相，回收溶剂后得含量≥95％的贯叶金丝桃素。该专利的制造步骤为：极性溶剂提取—减 压浓缩—非极性溶剂两相萃取—醇水除杂—碱性乙醇水溶液萃取—调pH＝0-4后非极性有机溶剂萃取—减压浓缩—正相硅胶柱层析分离—C18反相硅胶制备色谱分离—洗脱液经石油醚等非极性溶剂萃取—减压浓缩得贯叶金丝桃素精品等超过10个操作环节，操作过程非常复杂，不适合规模放大而用于生产。
由于贯叶金丝桃素的化学结构复杂，在非极性溶剂中的稳定性很差。过去的工艺技术往往由于收率低、成本高、制备量小或因过程复杂而难以实现工艺放大，从而导致目前市场上贯叶金丝桃素价格非常昂贵。
技术实现要素：
本发明提出一种提取纯化贯叶金丝桃素的方法，克服现有方法提取贯叶金丝桃素操作过程复杂和收率较低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种提取纯化贯叶金丝桃素的方法，包括以下步骤：
(1)对含有贯叶金丝桃素的金丝桃属(Hypericum Linn)植物进行预处理，所述预处理包括干燥、去枝梗和粉碎；
(2)用醇水溶液对预处理后得到的物料或含有贯叶金丝桃素的粗提物进行提取，然后进行固液分离，得到含有贯叶金丝桃素和金丝桃素的醇水溶液；
(3)将得到的醇水溶液用低极性有机溶剂萃取2-4次，低极性有机溶剂的每次用量为醇水溶液体积的1/2-1，得到低极性有机溶剂相和醇水相；
(4)低极性有机溶剂相在低于45℃的温度下减压回收溶剂并真空干燥或冷冻干燥，可得含量不低于30％的贯叶金丝桃素粗产品。
(5)含量不低于30％的贯叶金丝桃素粗产品用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中，聚酰胺柱床体积与粗产品重量相比应不少于100：3(V/W)；洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，可得贯叶金丝桃素含量为60％以上的蜡状固体。
优选地，步骤(2)中醇水溶液为体积分数60-70％的乙醇水溶液或70-85％的甲醇水溶液中的一种。
优选地，以1重量份的含有贯叶金丝桃素的植物原料为基准，步骤(2)中醇水溶液用量为20-60重量份。
优选地，步骤(2)中提取的温度为不高于45℃，提取的方法包括间歇或连续渗漉法、间歇搅拌浸提法、连续浸提法或超声波辅助浸提法中的一种。
优选地，步骤(3)中所述的低极性有机溶剂为石油醚、正己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、三氯乙烯、乙醚中的至少一种。
优选地，步骤(5)中，洗脱过程为：先用体积分数75-85％甲醇或65-75％乙醇水溶液其中一种洗脱2-4个柱体积，再用甲醇、95-100％乙醇或80-100％丙酮水溶液其中一种洗脱出贯叶金丝桃素。
现有提取技术中，是采用溶剂提取后直接浓缩成浸膏，再利用贯叶金丝桃素分子结构中的不可互变的烯醇式结构中的羟基的酸性，采取碱醇水从低极性有机溶剂中萃取，碱醇水相酸化后再用低极性有机溶剂中萃取出贯叶金丝桃素。我们做了对比试验，发现该方法只适合于少量快速的操作，如果生产量放大而致操作时间延长，发现贯叶金丝桃素在碱醇液中极不稳定而致收率很低。这种方法显然不能适合工业化放大生产。
我们在硅胶柱层析法分离贯叶金丝桃素的研究中发现，硅胶柱层析法也是只能在小柱中实现贯叶金丝桃素的分离，而当分离柱柱床高超过一定高度后，贯叶金丝桃素的收率接近于零。例如，我们在采用200-300目的硅胶进行柱层析分离时，柱床高度为90cm、流速为2倍柱体积/小时时，所得贯叶金丝桃素的回收率仅为23％。而当柱床高度达到110cm时，几乎得不到浅黄色的蜡状固体了。
我们在大孔吸附树脂柱法分离贯叶金丝桃素的研究中发现，选择了西安蓝晓等三个厂家的5种型号的大孔吸附树脂，分离效果均不理想，对提高贯叶金 丝桃素纯度的价值不大。我们在聚酰胺柱层析法分离贯叶金丝桃素的研究中发现，分离效果明显，浅黄色蜡状固体的得率理想，在柱高放大的状态下对贯叶金丝桃素的收率影响远没有硅胶柱那么大。经检测该蜡状固体中贯叶金丝桃素的含量可以达到60％以上。这一重大发现，表明我们找到了一种适合于工业化生产的贯叶金丝桃素的方法。在现有技术中，我们也没有发现利用聚酰胺柱层析的方法进行贯叶金丝桃素分离纯化的相关报道。
在对这一新的提取纯化贯叶金丝桃素的方法的优化过程中，我们首要考虑的因素是产品收率和产品纯度，再综合考虑溶剂的价格、回收难易、毒性与安全性等因素。通过单因素考察法，我们得到了本发明的提取纯化方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的植物原料均为金丝桃属植物贯叶连翘的干燥带花和幼果的枝条(长约20-30cm)，经过16目粉碎筛粉碎后备用，在实施例中称为“贯叶连翘粉”，经HPLC法检测该贯叶连翘粉中贯叶金丝桃素的平均含量为1.65％。
实施例1
取500克贯叶连翘粉，每次用3000mL的85％甲醇水溶液室温搅拌提取2小时、过滤，共提取三次，将每次得到的提取产物混合，得到8390mL含贯叶金丝桃素的醇水提取液。将所述醇水提取液用石油醚萃取4次，石油醚的每次用量为醇水提取液的1倍，石油醚层合并后在40℃的温度下减压回收溶剂并真空干燥，得贯叶金丝桃素粗产品14.62克，经测定含量为38.27％。
将13.51克贯叶金丝桃素粗产品，用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中(柱径3.5cm，柱高48cm)。先用85％甲醇 水溶液洗脱2个柱体积，再用甲醇洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，得5.92克浅黄棕色蜡状固体，该固体经检测贯叶金丝桃素的含量为78.22％。产品得率为1.18％，贯叶金丝桃素的收率为56.12％。
实施例2
取500克贯叶连翘粉，每次用3000mL的60％乙醇水溶液室温搅拌提取2小时、过滤，共提取三次，将每次得到的提取产物混合，得到8420mL含贯叶金丝桃素的醇水提取液。将所述醇水提取液用石油醚萃取2次，石油醚的每次用量为醇水提取液的1/3倍，石油醚层合并后在44℃的温度下减压回收溶剂并真空干燥，得贯叶金丝桃素粗产品11.98克，经测定含量为41.11％。
将11.55克贯叶金丝桃素粗产品，用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中(柱径3.5cm，柱高48cm)。先用65％乙醇水溶液洗脱4个柱体积，再用95％乙醇洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，得5.01克浅黄棕色蜡状固体，该固体经检测贯叶金丝桃素的含量为76.20％。产品得率为1.00％，贯叶金丝桃素的收率为46.28％。
实施例3
取500克贯叶连翘粉，每次用3000mL的80％甲醇水溶液室温搅拌提取2小时、过滤，共提取2次，将每次得到的提取产物混合，得到5560mL含贯叶金丝桃素的醇水提取液。将所述醇水提取液用石油醚萃取3次，石油醚的每次用量为醇水提取液的1/2倍，石油醚层合并后在40℃的温度下减压回收溶剂并冷冻干燥，得贯叶金丝桃素粗产品14.19克，经测定含量为45.44％。
将14.02克贯叶金丝桃素粗产品，用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中(柱径4.5cm，柱高50cm)。先用80％甲醇水溶液洗脱3个柱体积，再用甲醇洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，得6.16克浅黄棕色蜡状固体，该固体经检测贯叶金 丝桃素的含量为85.09％。产品得率为1.23％，贯叶金丝桃素的收率为63.54％。
实施例4
取500克贯叶连翘粉，每次用3000mL的70％甲醇水溶液室温搅拌提取2小时、过滤，共提取2次，将每次得到的提取产物混合，得到5540mL含贯叶金丝桃素的醇水提取液。将所述醇水提取液用正己烷萃取2次，正己烷的每次用量为醇水提取液的1/2倍，正己烷层合并后在40℃的温度下减压回收溶剂并真空干燥，得贯叶金丝桃素粗产品13.26克，经测定含量为34.39％。
将13.15克贯叶金丝桃素粗产品，用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中(柱径3.5cm，柱高45cm)。先用75％甲醇水溶液洗脱2个柱体积，再用丙酮洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，得5.44克浅黄棕色蜡状固体，该固体经检测贯叶金丝桃素的含量为63.15％。产品得率为1.09％，贯叶金丝桃素的收率为41.64％。
实施例5
取5kg贯叶连翘粉，每次用35L的80％甲醇水溶液室温搅拌提取2小时、过滤，共提取2次，将每次得到的提取产物混合，得到约64L含贯叶金丝桃素的醇水提取液。将所述醇水提取液用石油醚萃取3次，石油醚的每次用量为醇水提取液的1/2倍，石油醚层合并后在40℃的温度下减压回收溶剂并冷冻干燥，得贯叶金丝桃素粗产品155.22克，经测定含量为46.82％。
将148.6克贯叶金丝桃素粗产品，用甲醇溶解，聚酰胺拌样后常温真空干燥，干法上样于预先处理好的聚酰胺柱中(柱径10cm，柱高100cm)。先用80％甲醇水溶液洗脱3个柱体积，再用甲醇洗脱出贯叶金丝桃素，浓缩含贯叶金丝桃素的洗脱液至干并冷冻干燥，得64.73克浅黄棕色蜡状固体，该固体经检测贯叶金丝桃素的含量为84.16％。产品得率为1.29％，贯叶金丝桃素的收率为66.03％。
对比例1
按照实施例3的方法提取贯叶金丝桃素，不同的是，用回流提取替换常温搅拌提取步骤。结果只得到13.99克含量为15.32％的贯叶金丝桃素粗品。
显然，回流提取温度过高，不适合贯叶金丝桃素的提取。
对比例2
按照对比例3的方法提取纯化贯叶金丝桃素，不同的是，用硅胶柱分离法替代聚酰胺柱分离法的分离步骤中，所用的洗脱剂为石油醚。最终只得到2.63克含量为29.17％的贯叶金丝桃素产品。
显然，硅胶柱分离法不能用于贯叶金丝桃素的分离纯化。
从以上实施例和对比例的对比可以看出，采用本发明的提取方法，能够得到纯度和收率均较高的贯叶金丝桃素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。