引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用的制作方法

文档序号：12743838阅读：151来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用。

背景技术：

巴戟天(Morinda officinalis How)为茜草科植物，别名鸡肠风、鸡眼藤、黑藤钻、兔仔肠、三角藤、糠藤，主产于广东、福建、广西和海南。巴戟天以根部入药，性甘，味辛，微温；归肾、肝经；具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的作用。用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软。

巴戟天作为常用中药之一始载于《神农本草经》列为上品，此后历代本草均有记载。梁·陶弘景在《本草经集注》中对该生药有简单的描述：“状如牡丹而细，外赤内黑，用之打去心”。

巴戟天是我国著名的“四大南药”之一，其野生资源已近枯竭，在《中国植物红皮书—稀有濒危植物》一书中被列为三级保护植物。野生巴戟天多生长在茂密的树林中，荫蔽度比较大，而栽培巴戟天多种植于坡度较小的山坡上，多有小乔木或灌木遮阴。野生巴戟天由于长期处于野生状态，经受了各种灾害和不良环境的自然选择，往往保存了一般栽培种所不具有或已消失的某些重要特性，而栽培巴戟天在栽培过程中形成了多种农家类型。另外，与巴戟天形态相似的还有海巴戟(Morinda citrifolia L.)、鸡眼藤(Morinda parvifolia Bartl.)、南岭鸡眼藤(Morinda nanlingensis Y.Z.Ruan)等，这些植物同属巴戟天属，形态特征与巴戟天也极为相似，然而药用价值却与巴戟天存在较大差异。仅靠肉眼很难将巴戟天与海巴戟、鸡眼藤、南岭鸡眼藤区分，因此对巴戟天种质资源及其近缘种的研究成为了当务之急。

叶绿体是植物进行光合作用特有的细胞器，为植物提供能量的主要来源，叶绿体拥有自己的基因组。完整的叶绿体基因组一般包含四个部分，大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSR)和两段反向重复区(IR)。叶绿体基因组的进化速率在核基因组和线粒体基因组的进化速率之间。早期的叶绿体基因组测序比较复杂，随着新一代测序技术的发展，为叶绿体基因组的研究提供了很大的便利。叶绿体基因组是追溯叶绿体起源与演化历程的重要信息来源。通过比较进化基因组学分析，可以确定在叶绿体演化过程中，哪些基因发生了丢失，哪些基因转移到了核基因组，推断基因丢失和转移的根源。叶绿体基因组分析是解决植物系统发育难题的重要途径。叶绿体基因组可以提供基因组结构和DNA序列两个层次的数据用于系统发育分析，对某些疑难系统发育问题的解决提供了关键证据。叶绿体基因组还可以用来为物种鉴定提供重要理论依据。但目前，尚未有针对巴戟天叶绿体基因组进行种植鉴定的相关报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用。本发明提供的引物对能够实现对巴戟天种质的快速、准确鉴定。

本发明提供了如SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对。

本发明提供了如SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对。

本发明提供的引物对根据巴戟天叶绿体基因组特异性区域设计，该区域与相近物种的叶绿体基因组相比变异性较高，对该区域进行检测，能够实现对巴戟天种质的快速、准确鉴定。

如SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对的退火温度为56℃。

如SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对的退火温度为56℃。

本发明提供的引物对在巴戟天种质鉴定中的应用。

本发明提供的引物对能够鉴别巴戟天，特别是能够从形态学特征相近的多种巴戟天属植物中鉴别出巴戟天。所述形态学特征相近的巴戟天属植物包括：巴戟天，鸡眼藤，海巴戟和南岭鸡眼藤。

本发明还提供了一种巴戟天种质鉴定试剂盒，包括本发明提供的引物对。

本发明提供的该试剂盒中还包括PCR试剂。

所述PCR试剂可为分装的dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、扩增缓冲液。

作为优选，PCR试剂为Taq酶预混液。

本发明提供的试剂盒中还包括电泳试剂。

所述电泳试剂包括琼脂和染料。

所述染料为溴酚蓝和二甲苯青。

本发明提供的试剂盒中还包括DNA分子标记。

作为优选，DNA分子标记中包括不同分子量的DNA分子。

本发明实施例中，DNA分子标记中，包括分子量为分别为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp和200bp的DNA分子。

本发明提供的试剂盒中还包括PCR反应管。

本发明还提供了一种巴戟天种质鉴定方法，以待测样品的基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对、SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对为引物进行PCR扩增；

扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为巴戟天；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1349bp；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:5所示；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为905bp；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明中，待测样品为巴戟天，鸡眼藤，海巴戟或南岭鸡眼藤。

扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为鸡眼藤；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1366bp；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:7所示；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为818bp；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:8所示。

扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为海巴戟；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为779bp；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:9所示；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为892bp；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:10所示。

扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为南岭鸡眼藤；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1282bp；

以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:11所示；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为836bp；

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQ ID NO:12所示。

实际操作中，为了节省鉴定成本，采用电泳的方式对结果进行鉴定。优选为琼脂糖凝胶电泳。

本发明一个实施例中，巴戟天种质鉴定方法为，以待测样品的基因组DNA为模板，可先以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，若所得片段大小为779bp则鉴定为海巴戟，若所得片段大小为1282bp则鉴定为南岭鸡眼藤；若所得片段大小为1349bp～1366bp，难以通过肉眼对琼脂糖凝胶电泳结果进行分辨，则进一步以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，如所得片段大小为905bp则鉴定为巴戟天，若所得片段大小为818bp则鉴定为鸡眼藤。

待测样品DNA为基因组DNA。其提取采用植物基因组DNA提取试剂盒。

所述待测样品为新鲜茎、叶；或经干燥的茎、叶；或经炮制的茎、叶。

优选为新鲜叶片。

待测样品DNA提取前经液氮研磨。

本发明中，PCR扩增的反应体系为：

本发明中，PCR扩增的程序为：

对检测结果的判定可通过对扩增产物的电泳进行，也可通过对扩增产物的测序进行。为了缩短鉴定时间，结果的判定采用电泳的方式，所述电泳为琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。优选的，电泳为琼脂糖凝胶电泳。

本发明提供了核苷酸序列为SEQ ID NO:1～2和SEQ ID NO:3～4所示的引物对，并提供了这些引物对在巴戟天种质鉴定中的应用。采用本发明提供的引物对可仅通过PCR的方式对巴戟天进行鉴定，利用巴戟天叶绿体基因组中的特异性序列，能够实现对巴戟天的准确快速鉴定。从而能够从分子生物学的层面，实现对巴戟天属几种形态学相近物种的鉴别。进而避免了市场流通中巴戟天仿冒品的混入，提高了成品药的品质与用药安全性。

附图说明

图1示巴戟天鉴定PCR后经琼脂糖凝胶电泳检测后结果；其中，

泳道1示经SEQ ID NO:1～2所示引物对扩增的巴戟天基因组DNA；

泳道2示经SEQ ID NO:1～2所示引物对扩增的海巴戟基因组DNA；

泳道3示经SEQ ID NO:1～2所示引物对扩增的鸡眼藤基因组DNA；

泳道4示经SEQ ID NO:1～2所示引物对扩增的南岭鸡眼藤基因组DNA；

泳道5示经SEQ ID NO:3～4所示引物对扩增的巴戟天基因组DNA；

泳道6示经SEQ ID NO:3～4所示引物对扩增的鸡眼藤基因组DNA；

泳道M示DMarker III，Marker是由7条DNA片段组成，分别为4,500bp、3,000bp、2,000bp、1,200bp、800bp、500bp和200bp。

具体实施方式

本发明提供了引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的样品、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

市场购得巴戟天产品100份，经形态学和其他现有技术(指纹图谱等方式)鉴定，其中巴戟天70份，鸡眼藤12份，海巴戟9份和南岭鸡眼藤9份。

对各样品进行基因组DNA提取，首先使用液氮充分研磨待检的新鲜叶片，然后使用植物基因组DNA提取试剂盒(植物基因组DNA提取试剂盒，购买自康为世纪生物科技有限公司，目录号：CW0553)进行提取，提取步骤参考试剂盒说明书。

对各DNA样品进行扩增。扩增在苏州东胜兴业科学仪器有限公司ETC811 PCR扩增仪上进行；

首先，以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，反应体系特征为：在200μLPCR管中加入如下量的物质：2×Taq MasterMix 10μL，引物10μM上下游各0.75μL，已提取的DNA 1μL，ddH₂O 7.5μL，总体系为20μL；扩增程序条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，变性、退火、延伸三个步骤循环30次，最后再72℃充分延伸10分钟。扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物进行检测。

若所得片段大小为779bp则鉴定为海巴戟，若所得片段大小为1282bp则鉴定为南岭鸡眼藤；若所得片段大小为1349bp～1366bp，难以通过肉眼对琼脂糖凝胶电泳结果进行分辨，则进一步以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，

以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，反应体系特征为：在200μLPCR管中加入如下量的物质：2×Taq MasterMix 10μL，引物10μM上下游各0.75μL，已提取的已提取的DNA 1μL，ddH₂O 7.5μL，总体系为20μL；扩增程序条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，变性、退火、延伸三个步骤循环30次，最后再72℃充分延伸10分钟。扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物进行检测。

如所得片段大小为905bp则鉴定为巴戟天，若所得片段大小为818bp则鉴定为鸡眼藤。

对各样品的扩增结果如表1、图1：

表1：扩增产物片段长度(bp)

由表1可以看出，对100份巴戟天属样品进行鉴定，其结果与预期完全相符，说明本发明提供的引物对具有良好的准确性，其对巴戟天种质鉴定的准确率可达100％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 无限极（中国）有限公司

<120> 引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用

<130> MP1615917

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 2

<211> 19

<212> DNA

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<210> 5

<211> 1349

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgttgctttc taccacatcg tttcaaacga agttttagca tcacattcct cttaatttgg 60

aattggtatg gaattgattc aattgtgaaa tcatgcatag tcattggttt aattagtgtg 120

tatacgcccc aatctagact cttttcttcg atagatagat tggtaaatat ttttcggaag 180

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atcaaagatt cgacttaatt tctaaggaat tattaaatat aatgaaaaag gtgttgctat 300

cattatttga agaaaacagt aagggccata tttgatcatc atagaaaaaa gataagtata 360

agtccccttt tttgtaatat taattattaa tattaattga ataataaact cgatacaaca 420

aaaagtagga aaaagagttg ttttcctatc tatatctatt aaattgaatg aacaactacc 480

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ggtccagacg cttactccta ttaagtttga gtgaatttta ttagtaccaa aacaaaatag 900

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gtaatagata agattatgga aaattcgatt tttaataaaa tcgaaaagaa aaagaatagt 1020

tacaagaggt ttttctaaat aactaacttc cctaatccta aatagaaaga gtttgaacat 1080

atgatgaaaa ggccaaccga cttttttttg aagtcaaact ctcagaatcc aggttcctac 1140

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cattatttga agaaaacagt aagggccata tttgatcatc atagaaaaaa gataagtata 360

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