重组干扰素α1的产业化制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程与蛋白纯化领域，具体涉及一种重组猪干扰素α1(rpIFNα1)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的产业化生产的方法。
背景技术：
：干扰素(Interferon,IFN)是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN抗原性不同，可分为IFNα、IFNβ、IFNγ三种。其中IFNα是免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白，它具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抑制造血细胞增殖和免疫调节等功能，适用于病毒感染性疾病(如肝炎)、骨髓增生性疾病、淋巴细胞系肿瘤及其它肿瘤等疾病的治疗。我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物用干扰素的生产方法成为近年来的研究热点。唯一获得农业部“新兽药证书”和“生产批准文号”的猪干扰素是“猪白细胞干扰素”，它是通过病毒刺激细胞产生的活性蛋白混合物，存在单位体积活性效价低和猪血潜在病毒污染的问题。基因工程rpIFNα1具有广泛的抗病毒效应，并且具有无副作用、无药物残留等优点，在兽药领域具有广泛的应用前景。大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统，为了获得更高的蛋白产量研究人员开发了高密度发酵方法，但在高密度发酵过程中由于菌体密度较高往往会导致发酵复合培养基成本高、DO控制困难等问题。针对这些问题，菌株构建、发酵过程的控制、发酵培养基的筛选就显得尤为重要。此外，使用大肠杆菌作为真核生物来源蛋白的表达宿主时，由于大肠杆菌的高效表达、匮乏的蛋白翻译和修饰等多种因素导致真核蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式进行表达。包涵体是一种无活性的蛋白聚集体，需要进行人工复性才能获得相应的生理活性。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。技术实现要素：因此本专利要解决的四个技术层面的问题是：1、构建符合药用蛋白要求的rpIFNα1大肠杆菌表达菌株，实现高效表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rpIFNα1大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发rpIFNα1包涵体的变性和复性工艺；4、确立易于放大、成本低廉、工艺简单的纯化方法，制备高纯度、高生物活性的rpIFNα1。本发明目的之一在于提供一种rpIFNα1大肠杆菌的高密度发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵。所述的高密度发酵包括如下步骤：将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始加入补料培养基进行补料培养；待菌体生长至0D600≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM/L的IPTG在37℃进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L，七水合硫酸镁1.5-3g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O15g/L、MnSO4·5H2O5g/L、CaCl2·7H2O1g/L、CoCl·6H2O1g/L、Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO30.0625g/L、HCl41.75ml、Biotin0.5g/L。所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(V/V)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述补料培养基的流加速度维持在25-30g/h之间。DO是发酵过程中重要监控参数之一，对于有氧培养而言大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，同时发酵液中的氧浓度变化也是发酵过程监测和菌体生长情况的重要反馈信号之一。例如，在分批培养结束时要进行补料培养，而补料开始的信号则是DO的突然上升。一般而言，发酵液DO过低会造成菌体的生长缓慢、质粒丢失、蛋白产量低的问题；发酵液中DO过高则会导致菌体生长过快、代谢负荷过重、质粒丢失、蛋白产量低、能耗增大等问题。因此，控制发酵过程中的DO在合理区间是保证发酵结果的必要手段。一般情况下，对于高密度发酵而言，发酵的前期菌体代谢较慢可以通过提高转速和空气通气量来保证DO的稳定。随着菌体生长代谢趋于旺盛耗氧量随之提高，此时通过提高转速(转速过高会导致剪切力过大、菌体死亡及质粒丢失)和空气通气量无法满足对氧气的需求，因此需要通入纯氧以起到维持DO的作用。对于高密度发酵后期，随着生物量的增大，发酵液趋于粘稠，氧气传质下降，DO的控制会更加困难，此时氧气对于DO维持就更为重要。本发明通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-40％之间，具体来说就是，设定DO为30-40％，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.5-3L/min，然后通过逐渐提高转速(不超过900转)以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在30-40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。所述发酵种子活化方法具体为：将构建好的rpIFNα1大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。所述发酵一级种子液制备方法为：从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8-10h，此为一级种子液。所述发酵二级种子液制备方法为：将一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液。上述任何用于菌体培养的器皿和培养基在使用前均应进行过滤或者湿热灭菌，任何培养基在灭菌结束冷却后使用前均应加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素以保证纯种培养。本发明目的之二在于提供一种rpIFNα1包涵体变性前预纯化的处理方法，通过该方法可以去除rpIFNα1包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，降低下游纯化成本，提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。包括如下步骤：(1)菌体破碎收集后的rpIFNα1包涵体固体颗粒使用bufferB(20-100mMTris、0.5-5mMEDTA、100-300mM氯化钠、1mMPMSF、0.5-2％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；(2)将上步收集的猪干扰素α1包涵体使用bufferC(20-100mMTris、0.5-5mMEDTA、100-300mM氯化钠、1mMPMSF、0.5-2％TritonX-100、2-4M脲，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；(3)将上步收集的包涵体使用bufferD(20-100mMTris、0.5-5mMEDTA、1-1.5M氯化钠、1mMPMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；(4)将上步收集的包涵体使用bufferE(20-100mMTris、0.4M蔗糖、1mMPMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；(5)将上步收集的包涵体使用去离子水重悬至10-25g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rpIFNα1包涵体。本发明还提供了一种rpIFNα1包涵体变性的方法，具体包括如下步骤：(1)预纯化后的包涵体使用含有8-10M脲、或者8M脲和2M硫脲的bufferF(20-100mMTris、0.5-5mMEDTA、50-100mM氯化钠、1mMPMSF、5-10mMDTT，盐酸调节pH8.0)充分重悬至50-100g/L，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物；(2)将上步离心收集的上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步出去不溶物即得猪干扰素α包涵体变性液。本发明还提供了一种用于易于放大的rpIFNα1包涵体复性方法，该方法具有成本低廉、操作简单、复性蛋白活性高的特点。该方法包括：将rpIFNα1包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到复性缓冲液bufferG中，变性液流加的速度控制在1-2mL/min(对于5L复性缓冲液而言，其他复性体积的话进行相应的同比例缩小或者放大)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.05-0.3mg/mL之间，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于10-20℃条件下静置24-48h，复性结束。所述复性缓冲液bufferG为复性成败的关键，其主要组分包括：20-100mMTris、5-20％甘油、1-2M脲、0.5-5mMEDTA、1mMPMSF、0.1-1mMGSSG、0.3-3mMGSH。本发明还提供了一种rpIFNα1包涵体复性后样品的纯化方法，该方法具有操作简单和易于放大的特点。所述纯化方法是使用阳离子交换层析对rpIFNα1包涵体复性后样品纯化具体包括如下步骤：(1)将复性结束后的rpIFNα1包涵体复性液使用超滤法进行2倍以上浓缩，调节pH至6.5-7.0之间；(2)离心处理，收集上清液；(3)将上步上清液使用0.45μ膜过滤处理后上阳离子交换柱SP-FF纯化。纯化后的rpIFNα1SDS-PAGE电泳检测纯度达到90％以上。所述纯化方法中的超滤浓缩步骤旨在降低纯化前样品体积，可以在调节pH后的离心处理步骤之后，没有特别的顺序限定，如果不考虑上样前的样品体积的话该步骤也可省略。本发明的只经过一步纯化即可达到较高的标准，目的产物纯度可达到90％以上，这是常规纯化方法难以实现的。本发明的主要优点在于：1、提供的rpIFNα1使用的大肠杆菌表达菌株和表达载体符合相关制药领域的要求，并且具有较高的目的蛋白表达量和方便下游处理的特点。2、提供的rpIFNα1大肠杆菌高密度发酵方法具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点，并且提供的高密度发酵工艺具有蛋白产出高的特点(达到1.5g/L以上)。3、提供的菌体破碎方法具有易于放大、破碎率高、蛋白不易变性降解的特点。4、提供的包涵体变性溶解方法具有易于重复和放大、变性效果好的特点(90％以上)。5、提供的包涵体复性方法具有易于放大、操作简单、复性蛋白生物活性高(比活达到5-7×107U/mg)的特点。6、提供的包涵体复性液纯化方法具有步骤简单(一步阳离子交换层析纯化)、易于放大、操作简单的特点，经过一步纯化，样品电泳纯可以达到90％以上。附图说明图1：pET28a和pET21b-rpIFNα1酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；其中M：500bpDNALadder；Lane1：pET28a质粒酶切产物；Lane2：pET21b-rpIFNα1重组质粒酶切产物。图2：单克隆PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M：500bpDNALadder；Lane1-6：不同单菌落菌液对应的PCR产物。图3：实施例1rpIFNα1诱导表达后菌体超声裂解物上清及沉淀变性液SDS-PAGE图；M：蛋白质分子量标准；Lane1：rpIFNα1诱导表达后菌体超声裂解物上清；Lane2：rpIFNα1诱导表达后菌体超声裂解物沉淀的变性液。图4：实施例2发酵菌体沉淀变性液SDS-PAGE图；M：蛋白质分子量标准；Lane1：发酵产生rpIFNα1包涵体变性液。图5：实施例3菌体破碎前、破碎一次、破碎二次的样品培养菌落观察图。图6：实施例4预纯化后包涵体纯度检测SDS-PAGE图；M：蛋白质分子量标准；Lane1：发酵产生的未经预纯化rpIFNα1包涵体；Lane2：rpIFNα1包涵体经过第一步除杂蛋白缓冲液洗涤预纯化后的上清液；Lane3：预纯化处理后的rpIFNα1包涵体。图7：实施例7纯化后样品非还原电泳图；M：蛋白质分子量标准；Lane1：纯化后的rpIFNα1浓缩样品。具体实施方式下面将结合实施例对本发明进行进一步的阐述，需理解，这些实施例仅用于对本发明加以说明而不用于限制本发明。实施例1rpIFNα1大肠杆菌菌株的构建和表达鉴定发明人先前已经完成了rpIFNα1基因的针对大肠杆菌密码子优化、mRNA自由能优化，并将优化后的rpIFNα1基因插入到了pET21b载体构建成重组表达质粒，记为pET21b-rpIFNα1；该表达质粒pET21b-rpIFNα1使用分子克隆的手段被导入到大肠杆菌BL21(DE3)(记为BL21(DE3)-pET21b-rpIFNα1)表达宿主中并实现蛋白高效表达，具体可见专利(申请号：201310025176.8)所述。为了将rpIFNα1基因从pET21b载体克隆至pET28a中，参见如下步骤：1、取冻存于-80℃冰箱的BL21(DE3)-pET21b-rpIFNα1和DH5α-pET28a(本实验室保存)菌株甘油管，融化后接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm摇床过夜培养后使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提(购自于天根生化科技有限公司)。2、将pET28a质粒和pET21b-rpIFNα1重组质粒同时使用XbaI和XhoI限制性内切酶(购自于NEB)进行双酶切，酶切结束后对酶切产物进行琼脂糖电泳凝胶分析(分析结果如图1所示)，使用DNA纯化回收试剂盒(购自于天根生化科技有限公司)回收酶切产物片段，回收操作按照试剂盒说明书进行。3、将回收的rpIFNα1和pET28a酶切产物使用T4DNA连接酶(购自于NEB)进行酶连，酶连方案使用连接酶说明书推荐方案进行，酶连结束后将酶连产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自于天根生化科技有限公司)。转化完毕后，将感受态细胞涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃，过夜培养。4、从转化平板上挑取单克隆接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h。培养完毕后取出部分菌液，作为PCR扩增模板对单菌落进行PCR鉴定，PCR引物为T7启动子通用引物。PCR扩增体系为50μL，所使用DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶(购自于天根生化科技有限公司)，所使用扩增条件按照说明书推荐方案进行。PCR结束后，使用1％琼脂糖电泳凝胶进行分析，分析结果如图2所示。5、使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提，将所抽提质粒进行DNA测序。比对分析测序结果，测序结果正确的质粒对应菌株即为阳性的目标菌株，记为BL21(DE3)-pET28a-rpIFNα1。6、取BL21(DE3)-pET28a-rpIFNα1甘油管按照1％接种量接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0时加入终浓度为1mMIPTG进行诱导表达，37℃诱导表达4h后离心收集菌体。7、将步骤6中诱导表达后菌体使用PBS重悬至0.05g/mL，使用探针式超声波细胞破碎仪进行超声破碎，破碎条件为：200W工作3s间隔4s，共计超声破碎28min。将超声破碎后产物10000g/20min离心收集，分别收集上清和沉淀。取沉淀使用上文提到的含有8M脲的bufferF(50mMTris、1mMEDTA、100mM氯化钠、1mMPMSF、5mMDTT，盐酸调节pH8.0)变性溶解，然后将制备的超声裂解物上清和变性液进行SDS-PAGE电泳分析，分析结果如图3所示。通过图3可以看出rpIFNα1以包涵体形式进行表达。实施例2rpIFNα1高密度发酵本实施例主要阐述了BL21(DE3)-pET28a-rpIFNα1菌株的高密度发酵工艺，发酵工艺中使用成分明确的葡萄糖和甘油作为菌体代谢的碳源，使用磷酸氢二铵作为菌体代谢的氮源；由于避免使用类似于酵母粉、蛋白胨之类的复合培养基，避免了复合氮源/碳源带来的批次之间不稳定性，因此不同发酵批次的培养基成分可以很容易实现控制，并且由于葡萄糖和甘油成本较低，因此发酵工艺总体成本得到良好的控制。发酵结束后发酵菌体OD600可达90-100之间，目的蛋白表达量达到1.5g/L以上。制备例1具体步骤如下：1、发酵种子液的制备：将实施例1中构建好的rpIFNα1大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化；2、从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8h，此为一级种子液。3、将步骤2中的一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液制备。4、分批发酵培养基的成分：一水合柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾13g/L，磷酸氢二铵4g/L，葡萄糖15g/L，七水合硫酸镁1.5g/L；按照分批发酵培养基的成分称取3L量的试剂，使用2L单蒸水溶解后，调节pH至6.5，定容至3L。将配好的分批发酵培养基倒入发酵罐(NBS-3L)进行灭菌，冷却后，通过注射器向发酵罐中打入3mL上文中提到的微量元素母液(过滤除菌)和终浓度为50μg/mL的卡那霉素(过滤除菌)抗生素。按照补料培养基的成分称取500mL量的相关试剂(甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L)补料培养基，定容至500ml后121℃，20min灭菌处理，使用前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的前述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。5、将制备好的二级种子液按照10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基的发酵罐中开始补料-分批高密度发酵培养，设定发酵温度为37℃、pH为6.8、DO40％，pH使用氨水和磷酸(20％)进行关联调节，DO通过关联转速、通气量和高纯氧进行控制。发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在25-30g/h范围)。待菌体生长至0D600≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为1.0mM的IPTG37℃进行诱导表达，诱导表达6h结束培养。取部分发酵菌体使用实施例1中的第7步方法进行SDS-PAGE表达分析，分析结果如图4所示。使用离心法收集发酵液中的菌体，所收集得到菌体可以进行进一步破碎处理也可冻存于-40冰箱中备用。制备例中列出的具体条件仅用作说明而非限制本发明。制备例1中的分批发酵培养基是高密度发酵的关键，组分明确、成本低廉，在制备例1的基础上对培养基组分含量进行微调(见表1)，同时步骤5的高密度发酵参数也进行微调(见表2，表中未列参数与制备例1相同)，取制备例2、3的发酵菌体使用实施例1中的第7步方法进行SDS-PAGE表达分析，结果和制备例1基本一致。表1参数制备例1制备例2制备例3一水合柠檬酸1.5g/L0.5g/L3g/L磷酸二氢钾13g/L8g/L15g/L磷酸氢二铵4g/L3g/L7g/L葡萄糖15g/L10g/L20g/L七水合硫酸镁1.5g/L2.5g/L3g/L表2参数制备例1制备例2制备例3接种量10％515pH6.87.07.2DO40％30％35％IPTG1.0mM0.5mM0.75mM诱导表达时间6h4h5h实施例3发酵菌体高压均质破碎本实施例阐明了发酵菌体的破碎方法，该方法为物理法和酶法的联用，可以取得更好的菌体破碎效果。但本实施例仅用于举例说明菌体破碎方法，并不用于限制本发明，只要能否充分破碎菌体的方法均可用于本发明。具体来说本发明的菌体破碎方法就是发酵菌体使用缓冲液重悬后加入溶菌酶处理，对于大肠杆菌这种革兰氏阴性菌来说溶菌酶可以破碎细胞壁从而起到菌体破碎的效果。菌体经过溶菌酶初步破碎处理后使用高压均质机法进行物理破碎，该方法是目前工业应用中发展成熟的一种菌体细胞裂解的方法。使用该方法进行细胞物理破碎的过程中由于全程都处于一个低温的过程，因此可以保证目的蛋白在破碎过程中不因温度升高而失活。具体如下：1、发酵菌体使用bufferA(50mMTris、1mMEDTA、100mM氯化钠、1mMPMSF、0.5mg/mL溶菌酶，盐酸调节pH8.0)充分重悬至菌体浓度为100g/L，室温搅拌1.5h。2、使用ATS-AH1500高压均质机对发酵菌体进行物理破碎，调节压力900bar，进行均质破碎2次，6500g/20min离心收集rpIFNα1包涵体，离心后所得上清丢弃，沉淀即为包涵体。3、取等体积的菌体破碎前的重悬液、破碎第一次的样品、破碎第二次后的样品，稀释处理后涂布LB固体平板，于37℃培养箱培养12h，培养完毕后观察三者之间菌落数目差别，结果如图5所示。4、通过对发酵菌体破碎前和破碎后样品平板培养比较后可以看出，使用物理和酶法联用的菌体破碎方法可以菌体破碎率可以达到99％以上。实施例4rpIFNα1包涵体的预纯化本实施例阐述了rpIFNα1包涵体的预纯化，通过预纯化处理去除rpIFNα1包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，可以降低下游纯化成本、提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。实施例2制备例1得到的发酵菌体按照实施例3收集得到的rpIFNα1包涵体固体颗粒，预纯化步骤具体如下：1、使用bufferB(50mMTris、1mMEDTA、100mM氯化钠、1mMPMSF、1％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L(包涵体质量按湿重计算)，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次2、将步骤1收集的猪干扰素α1包涵体使用bufferC(50mMTris、1mMEDTA、100mM氯化钠、1mMPMSF、1％TritonX-100，4M脲盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。3、将步骤2收集的包涵体使用bufferD(50mMTris、1mMEDTA、1M氯化钠、1mMPMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。4、将步骤3收集的包涵体使用bufferE(50mMTris、0.4M蔗糖、1mMPMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。5、将步骤4收集的包涵体使用去离子水重悬至10g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rpIFNα1包涵体。将预纯化后的包涵体按照上述实施例1中的第7步方法进行变性，然后SDS-PAGE检测包涵体纯度，分析结果如图6所示，通过电泳检测分析可以看出通过预纯化后包涵体中杂蛋白得到了部分的去除，起到了纯化的作用。对预纯化后的包涵体性液使用QuantityOne软件进行灰度分析，纯度约为42％。6、将步骤5最终收集得到的包涵体蛋白使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，干燥至恒重后称量干燥后样品的质量。换算后可得1L发酵液最终可以获得4g预纯化后包涵体冻干粉，折算纯度后可得每升发酵液可以获得1.68g目的蛋白。实施例2制备例2、3得到的发酵菌体按照实施例3收集得到rpIFNα1包涵体固体颗粒，预纯化步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表3，表中未列参数与制备例1相同。表3用制备例1相同的方法进行纯度和含量的计算，制备例2、3纯度每升发酵液产量和制备例1基本一致。实施例5rpIFNα1包涵体变性包涵体的变性是复性前必要步骤，变性的充分程度直接影响着后续的复性效果。一般而言包涵体的变性剂包括：8-10M脲、4-6M盐酸胍、SDS、高浓度DTT等。相比较而言，由于具有较低的使用成本和变性强度(易于放大过程中的使用)，脲被广泛应用于包涵体变性。本实施例阐述了rpIFNα1包涵体变性的手段，通过该手段进行变性后的rpIFNα1包涵体可以进行下一步的复性，实施例4制备例1得到的预纯化的包涵体变性步骤如下：1、预纯化后的包涵体使用含有8M脲bufferF(50mMTris、1mMEDTA、100mM氯化钠、1mMPMSF、5mMDTT，盐酸调节pH8.0)充分重悬至50g/L(按湿重计)，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物。2、将上步离心收集的上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步除去不溶物即得rpIFNα1包涵体变性液。实施例4制备例2、3得到的预纯化的包涵体变性步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表4，表中未列参数与制备例1相同。表4实施例6rpIFNα1包涵体变性液的稀释复性本实施例阐述了rpIFNα1包涵体稀释复性方法，该方法的原理是通过人工配制的复性缓冲液从而提供一种蛋白折叠环境，将变性后蛋白溶液缓慢的加入到复性缓冲液中从而实现变性剂浓度的降低诱发蛋白折叠形成正确的高级结构，最终形成有活性的rpIFNα1。该方法在操作中只需要进行一步稀释，操作简单，因此在工业上很容易实现放大，所复性蛋白经过细胞活性测定表明活性可以达到5×107U/mg以上，在目前报道中属于较高水平。制备例1的复性具体步骤如下：1、配制5L包涵体复性bufferG(50mMTris、1mMEDTA、1mMPMSF、5％甘油、1M脲、1mMGSSG、3mMGSH，盐酸调节pH至8.0)。2、取部分实施例5制备的rpIFNα1包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到步骤1制备的复性缓冲液中，变性液添加的过程中保持复性液被快速搅拌以便变性液可以快速的混匀。变性液流加的速度控制在1-2mL/min(对于5L复性缓冲液而言)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.1mg/mL左右，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于15℃条件下静置36h，复性结束。实施例5制备例2、3得到的变性液复性步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表5，表中未列参数与制备例1相同。表5实施例7rpIFNα1包涵体复性样品的纯化制备该实施例阐述了rpIFNα1包涵体复性后样品的纯化方法。使用DNAMAN预测rpIFNα1的等电点为7.58，因此在小于该等电点pH条件下可以使用阳离子交换色谱进行rpIFNα1的纯化制备。发明人使用SPSepharoseFastFlow填料对rpIFNα1复性样品进行纯化，纯化结束后非还原电泳检测纯度可达到90％以上，因此该方法具有操作简单和易于放大的特点。实施例6复性液的纯化具体步骤如下：1、5LrpIFNα1包涵体复性液使用PALL台式超滤系统(选用3KDa膜包)进行超滤浓缩，浓缩至体积为2.5L。2、将上述超滤浓缩后的复性液，调节pH至7.0，离心处理，收集上清液，将上清液使用0.45μm膜过滤处理。3、使用AKTAPurifier纯化系统，阳离子交换柱SepharoseFastFlow(xk26柱材，柱床体积为30mL)对步骤2中样品进行纯化。平衡缓冲液(50mMTrispH7.0)，洗脱用缓冲液(50mMTris1M氯化钠pH7.0)。首先使用平衡缓冲液对柱床进行平衡，平衡至pH、电导率、UV280稳定，然后10mL/min上样，上样结束后再次使用平衡缓冲液平衡至pH、电导率、UV280稳定。线性洗脱：逐渐提高洗脱液经过柱床的浓度，在10个柱体积，经过柱床的洗脱缓冲液浓度达到30％，当UV280>15mAu时开始收集样品，将纯化收集的样品使用截留分子量为3KDa的超滤浓缩管进行超滤浓缩，取浓缩后的样品使用非还原电泳进行纯度检测，分析结果如图7所示，使用QuantityOne软件对电泳结果进行灰度分析，分析纯度为93％。制备例2、3的纯度也在93％左右。实施例8rpIFNα1包涵体复性样品的抗病毒活性测定1、预先培养好的IBRS-2单层细胞，用0.05％Trypsin消化后用10％FBSMEM稀释至合适的细胞密度(约2.5×105个/ml)的细胞悬液，铺96孔细胞板100μl/孔，37℃5％CO2培养4h左右，待其贴壁。2、等细胞贴壁后，将重组猪干扰素α1样品进行4倍梯度稀释，做12个梯度，每个梯度重复3个孔，稀释用7％FBSMEM培养基。将稀释后的猪干扰素样品一次加入贴壁的96孔细胞板进行换液，100μL/孔，细胞对照和病毒对照孔各加入100μL稀释液，37℃5％CO2过夜培养18-24h，长至均匀单层细胞。3、用BCA法检测重组猪干扰素α1复性后纯化样品的蛋白浓度，用于比活的计算。4、弃上清，向每孔中加入100μLVSV病毒液(约1-2×102TCID50/孔)，细胞对照孔加100μl维持液(3％FBSMEM培养基)，VSV稀释用3％FBSMEM培养基。加完后置37℃5％CO2培养约24h。5、攻毒后约24h，在倒置显微镜下观察细胞病变，统计各稀释度CPE孔和无CPE孔数。病毒对照孔75％以上细胞出现病变(“++++”)时，判定结果。病变程度“++”及以上判为CPE孔，否则判为无CPE孔。病变程度用以下符号表示：“-”表示细胞无病变；“+”表示25％以下的细胞有病变；“++”表示25％-50％的细胞有病变；“+++”表示50％-75％的细胞有病变；“++++”表示75％-100％的细胞有病变；6、按Reed-Muench两氏法计算猪干扰素效价，猪干扰素活性单位以U表示。能保护半数细胞免受攻击病毒破坏的猪干扰素最高稀释度的倒数，即为猪干扰素效价。再根据蛋白浓度计算比活。举例：Reed-Muench两氏法计算待测样品猪干扰素效价，如表6所示。(下表所列无CPE孔数、出现CPE孔数的数值仅为本例说明的随机取值，并非实验具体数值)表6病毒液特定稀释度时的CPE孔数：从最低稀释度出现的CPE孔数逐个累加至该特定稀释度时的CPE孔数，如稀释度为10-1的CPE孔数为稀释度为10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1时的CPE孔数的逐个累加，即0+1+3+7+8+8＝27；稀释度为10-2的CPE孔数为稀释度为10-6、10-5、10-4、10-3、10-2时的CPE孔数的逐个累加，0+1+3+7+8＝19。病毒液特定稀释度时的无CPE孔数：从最高稀释度无CPE孔数逐个累加至该特定稀释度时的无CPE孔数，如稀释度为10-2的无CPE孔数为稀释度为10-1、10-2时的无CPE孔数的累加，即0+0＝0；如稀释度为10-3的无CPE孔数为稀释度为10-1、10-2、10-3时的无CPE孔数的累加，即0+0+1＝1。CPE：Cytopathiceffect细胞病变距离比＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(75-50)/(75-25)＝0.5Log4(X)＝距离比×稀释度对数之间的差、高于50％病变率的稀释度的对数＝0.5×(-1)+(-6)＝-6.5含义：猪干扰素稀释度到4-6.5时，能保护半数细胞免受攻击病毒破坏。该稀释度的倒数1/X，即为0.1ml待测样品含有的猪干扰素活性单位(U)，本例中待测样品的效价为46.5×10＝8.19×104U/ml。7、根据步骤6中rpIFNα1活性测定的结果换算比活，结果如表7所示。表7重组猪干扰素α1抗病毒活性测定结果当前第1页1 2 3