一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在生物修复石油污染环境中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

石油作为现代工业的血液，为人类文明的进步和发展做出了巨大贡献。然而石油在给人们带来巨大经济利益的同时，也对生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以及储存过程中，石油所造成的土壤污染问题是一个长期存在的环境问题，石油污染使得土壤理化性质发生改变，不利于农作物生长；石油烃中不易被土壤吸附的部分会逐渐渗入到地下，进一步污染地下水源。因此治理石油所造成的土壤污染具有十分重要的现实意义，针对石油污染土壤的修复研究也是目前环境保护领域中的研究热点(2003年，Hamme等)。

目前土壤中石油污染的处理方法按其性质可分为3种：物理方法，化学方法和生物方法。物理方法包括挖掘填埋法、气提吹脱法、电解法、洗涤法和隔离控制法等；化学方法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法等等。以前使用的主要是这两类方法，虽可产生一定的实效，但是处理费用昂贵而且容易造成严重的二次污染。相较而言，生物方法具有物理方法和化学方法不可比拟的优势，首先是处理费用低，其处理成本大约只有物化方法的三分之一；其次是修复操作简单，可以原位进行修复(2011年，Mukherjee和Bordoloi)；再次生物法修复对环境的二次污染较小(2002年，Ron和Rosenberg)。

石油烃降解菌是能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称。石油烃降解菌在石油污染环境的生物修复中有着重要的作用，在微生物采油研究领域的应用日趋广泛(1997年，何良菊等)。由于自然界中的微生物具备资源丰富、易于培养和对环境的耐受性较强等诸多优点，对于生物修复石油污染环境具有广阔的应用前景。但检索发现目前有关能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在生物修复石油污染环境中的应用还鲜见报道。

参考文献

1.Hamme J.D.V.,Singh A.,Ward O.P.Microbiol Mol Biol Rev,2003,67(4):503-549.

2.Mukherjee A.K.,Bordoloi N.K.Environ.Sci.Pollut.Res.Int,2011,471:478.

3.Ron E.Z.,Rosenberg E.Curr.Opin.Biotechnol,2002,249:252.

4.何良菊，魏德洲，张维庆.环境科学进展,1997,7(3):110-115.

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决问题是提供一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在修复石油污染环境中的应用。

本发明所述能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11427。

上述的能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其生物学特征是：呈现杆状，单个，细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(1.3μm～2.0μm)，20-24小时开始生孢子，37℃固体培养时菌落初期呈椭圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状，菌落扁平且不透明、表面粗糙、边缘不齐；其生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，最适生长温度为30～37℃，最适合生长pH值为6.5～7.5，生理生化实验结果与地衣芽孢杆菌模式菌株相比一致，详见表1。

表1：Yb1菌株与Bacillus licheniformis的生理生化特征比较

注：“+”表示菌株阳性；“-”表示菌株阴性。

*：东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版，p62-63

上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，并调节pH 7.5。

上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH 7.5。

上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。

上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。

实验证实：本发明所述的Yb1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上培养时能够降解石油，同时产生明显的降解圈，结果见图3。测定显示该菌株对石油的降解率接近43％。预示其在治理石油污染土壤或水体方面具有较好的应用前景。

对本发明所述菌株Yb1测定16S rRNA基因序列的结果显示，其基因序列长度为1419bp，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的Yb1菌株16S rRNA的基因序列与NCBI注册的多株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)16S rRNA的基因序列具有高度同源性，可以确定本发明所述Yb1菌株是一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

选取同源性比较高的典型地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的16S rDNA序列作为参比对象；采用邻近法(Neighbour-Joining)运用Mega 5软件构建Yb1菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonas aeruginosa作为外群分支。结果见附图4。

本发明所述的能降解石油的地衣芽孢杆菌Yb1菌种选育的基本方法是：

将采集到的石油污染的土壤样品用无菌生理盐水溶解，振荡混匀制成土壤悬液，梯度稀释涂布平板，37℃条件下静置培养，至有明显的石油降解圈出现，挑取石油降解圈较大的菌落，划线转接到固体培养基，37℃条件下静置培养，至有明显的单菌落产生，经两次纯化后，甘油冻藏保菌。该菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11427。

本发明所述能高效降解石油的地衣芽孢杆菌在降解石油中的应用或在生物修复石油污染环境中的应用。

其中：所述石油污染环境优选是指石油污染的土壤或石油污染的水。

具体的，上述应用涉及的方法是：

(1)菌种选择：选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株；

(2)斜面培养活化菌种：将菌种接种于斜面培养基，35～40℃条件下，静止培养20～40小时，备用；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株在无菌条件下用接种环接1～2环于含有50mL液体种子培养基的三角瓶(250mL)中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养18～24小时，得种子液；

(4)生物修复石油污染环境及石油分解率检测：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于模拟石油污染环境的含有50mL已添加100mg原油的无机盐培养基的三角瓶(250mL)中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养8～10天；然后用四氯化碳萃取培养基中残留的石油烃，以四氯化碳作参比溶液，采用红外分光光度计于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处测量其吸光度值；同时将不接入Yb1菌株的培养基作为空白对照，在相同条件下进行测定，按照中华人民共和国国家环境保护标准(HJ 637-2012水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法)中列出的公式计算样品中总石油烃的含量，得出石油分解率；

其中：

上述斜面培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH 7.5；

上述液体种子培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，并调节pH 7.5。

上述无机盐培养基组成为：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，原油5g/L，pH 7.0，蒸馏水配制。

上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选37℃±0.2℃。

上述方法中，步骤(2)、(3)所述培养时间优选24小时。

上述方法中，步骤(4)所述种子液接入体积比优选2％。

本发明公开的一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1可以将石油作为唯一碳源，降解石油，且降解率较高，预示其可用于石油污染的土壤或水体的治理，在消除石油污染方面具有较好的应用前景和经济价值。

附图说明

本发明所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.11427。

图1为地衣芽孢杆菌Yb1菌株在显微镜下的细胞形态。

图2为地衣芽孢杆菌Yb1菌株在显微镜下的芽孢形态。

图3为地衣芽孢杆菌Yb1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上的菌落形态。

图4为地衣芽孢杆菌Yb1菌株与参比菌株之间的系统进化树。

具体实施方式

下面通过给出的具体实施例对本发明内容做详细说明和深入理解，但下述实施例仅对本发明进行解释而不是对本发明保护范围的限定。

实施例1：能高效降解石油的地衣芽孢杆菌的筛选

取1g采集到的石油污染的土壤样品，放入250ml三角瓶中，向其中加入9ml无菌生理盐水，振荡混匀制成土壤悬液，按10倍的浓度梯度进行倍比稀释。分别取100μl稀释度为10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤悬液，滴加到以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上，用涂布棒涂抹均匀，在37℃条件下静置培养7天。

待有明显的石油降解圈出现，用接种环挑取石油降解圈较大的菌落，在固体培养基上进行划线，在37℃条件下静置培养，至有明显的单菌落产生。转接划线两次。

用接种环挑取单菌落，转接到装有8ml液体培养基的试管中，在37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。向冻藏管中分别加入200μl甘油和800μl的菌液，混合均匀后放置-80℃超低温冰箱中保存，菌株编号为Yb1。

上述无菌生理盐水组成为：0.85％NaCl溶液。

上述无机盐固体培养基组成为：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，琼脂粉15g/L，原油5g/L，pH 7.0，蒸馏水配制。

上述固体培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH 7.5。

实施例2：Yb1菌株形态观察及生理生化特征鉴定

采用尼康倒置显微镜的油镜对Yb1菌株的形态进行观察。

Yb1菌株生理生化特征鉴定方法参照东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社，2001，第一版)，鉴定试验培养温度均设为37℃。同时分析Yb1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上生长时的最适温度与最适合生长pH值。

Yb1菌株的生物学特征是：呈现杆状，单个，细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(1.3μm～2.0μm)，20-24小时开始生孢子，37℃固体培养时菌落初期呈椭圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状，菌落扁平且不透明、表面粗糙、边缘不齐。(见图1)

Yb1菌株的生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，发酵葡萄糖产酸，过氧化氢酶试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解和明胶水解试验呈现阳性，发酵葡萄糖产气试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、甲基红试验呈现阴性。最适生长温度为30～37℃，最适合生长pH值为6.5～7.5，生理生化实验结果与地衣芽孢杆菌模式菌株相比一致，详见表1。

表1：Yb1菌株与Bacillus licheniformis的生理生化特征比较

注：“+”表示菌株阳性；“-”表示菌株阴性。

*：东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版，p62-63上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，并调节pH 7.5。

上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH 7.5。

Yb1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上培养时能够降解石油，同时产生明显的降解圈，结果见图3。

Yb1菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.11427。

实施方式3：Yb1菌株的16S rRNA基因鉴定

根据TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(TianGen公司，货号DP302-02)的操作说明，提取分离纯化的Yb1菌株的总基因组DNA。提取的总基因组DNA采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，取3.0μl总基因组DNA样品与0.6μl 6×Loading Buffer充分混合均匀后注入点样孔中，Marker选用λ-Hind III DNA Marker，电泳电压120V，电泳时间35分钟。选用上游引物27F(5’-3’：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和下游引物1492R(5’-3’：GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增分离菌株的16S rRNA基因，PCR反应体系和条件如下表所示：

PCR产物采用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，取3.0μl PCR产物与0.6μl 6×Loading Buffer充分混合均匀后注入点样孔中，Marker选用DL 2000DNA Marker，电泳电压120V，电泳时间30分钟。根据TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒(TianGen公司，货号DP209-02)的操作说明，对PCR产物进行纯化回收，回收后的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳方法同上。纯化回收后的PCR产物送往测序公司进行测序。

将测序所得的16S rRNA基因序列递交到NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLASTN比对。结果显示该菌株的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中其他衣芽孢杆菌的16S rRNA基因序列的同源性非常高，个别菌株的相似性甚至高达100％。选取同源性比较高的典型的Bacillus licheniformis 16S rRNA基因序列作为参比对象；采用邻近法(Neighbour-Joining)运用Mega 5软件构建Yb1菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonas aeruginosa作为外群分支。结果见图4。

实施例4：Yb1菌株在生物修复石油污染中的应用方法步骤是：

(1)菌种选择：选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株；

(2)斜面培养活化菌种：将菌种接种于斜面培养基，37℃条件下，静止培养40小时，备用；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于含有50mL液体种子培养基的三角瓶(250mL)中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养24小时，得种子液；

(4)生物修复石油污染环境及石油分解率检测：以2％的体积比的接种量，将种子液接种于模拟石油污染环境的含有50mL已添加100mg原油的无机盐培养基的三角瓶(250mL)中，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养8～10天；

将培养基转移至分液漏斗中，加入10ml四氯化碳振荡3min，期间经常开启旋塞排气。静置分层后，将下层有机相转移至事先已加入3g无水硫酸钠的锥形瓶中，摇动数次除去残留的水分。如果无水硫酸钠结晶成块，需要补加无水硫酸钠，静置。用四氯化碳作参比溶液，采用红外分光光度计于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处测量其吸光度值。设置3个平行实验，取3组实验数据的平均值，同时计算正负误差。将不接入Yb1菌株的培养基在相同条件下进行处理，作为空白对照。按照中华人民共和国国家环境保护标准(HJ 637-2012水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法)中列出的公式计算样品中总石油烃的含量。

结果显示，接入Yb1菌株后，培养基中总石油烃的含量从最初的100mg下降至57±4mg，石油的去除率接近43％。

上述斜面培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH 7.5。

上述液体种子培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，并调节pH 7.5。

上述无机盐培养基组成为：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，pH 7.0，蒸馏水配制。

序列表

<110>山东大学

<120>一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用

<141> 2016-11-21

<160> 1

<210> 1

<211> 1419

<212> rRNA

<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）

<221> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Yb1 CGMCC No.11427

<222>（1）…（1419）

<400> 1

tcggcggctg gctccaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120

ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180

tgtgggattg gcttagcctc gcggcttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg 240

tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420

tgtcactctg cccccgaagg ggaagcccta tctctagggt tgtcagagga tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gtttgctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780

tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc 840

cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgcg cgctttacgc 900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccgccct attcgaacgg tacttgttct 1020

tccctaacaa cagagtttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 1080

cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140

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