本发明涉及饲料原料及加工工艺技术领域，尤其涉及一种耐高温植酸酶活性评估方法。
背景技术：
磷在畜禽营养中具有重要作用，动物必须从饲料中获得足够的磷，才能维持正常的生命活动，达到较好的生产性能。植物性饲料中总磷含量很高，但其存在形式大多为植酸磷，很难被畜禽消化利用，而植酸酶可以释放植物性饲料中植酸磷的磷，从而减少外源磷的使用量，节省成本，并减少环境污染。另外，由于植酸往往和其他养分(如锌、铁等)以络合物的形式存在，不易解离，使用植酸酶可以提高此部分养分的使用效率。再者，有证据表明，NSP酶等外源酶作用的发挥效果有赖于植酸酶的支持；在没有使用植酸酶的情况下，NSP酶作用效果不佳。因此，在饲料中添加植酸酶具有重要作用。
植酸酶本身具有蛋白质性质，高温、强酸、强碱、蛋白质消化酶等因素易使植酸酶变性失效。大部分植酸酶的最适温度都集中在40～70℃，但根据市场需求已有大量耐热性植酸酶出现在市场上，其耐温上限能达到95％，但其对饲料制粒过程的耐受性仍然备受关注。同时，植酸酶的最适pH一般在5.0～7.0，很容易在动物胃中失活，因此，测定高温、强酸、有胃蛋白酶存在的条件下植酸酶活性对饲料原料的选择具有重要作用。
目前耐高温植酸酶的检验方法多采用水浴法、干热法或湿热法对耐高温植酸酶进行处理，然后使用GB/T 18634—2009《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》对酶活性进行检验，但其前期样品处理中设置条件并不能完全模拟实际现场的制粒条件，结果相差较大，实际参考价值较低，且其后期植酸酶活性检验并没有考虑饲料在胃蛋白酶和强酸环境下的损失，对饲料配方中的添加量没有现实指导意义，本发明就以上问题做以针对性的解决，充分考虑实际生产环境中的各个环节对耐高温植酸酶影响，综合评定耐高温植酸酶在动物体内的有效活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种耐高温植酸酶活性评估方法，通过模拟制粒的高温、高湿环境和胃环境内底物释放水溶性磷的多寡，来判定耐高温植酸酶在模拟制粒过程后在体内的实际作用效果。
为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种耐高温植酸酶活性评估方法，首先将饲料样品与高温植酸酶充分混合，同时作空白对照,然后放置高压灭菌锅内在75℃-90℃反应3min，反应结束后迅速将铝塑袋取出置于冰水混合物中快速冷却至室温；然后在体外微环境进行模拟消化，最后采用比色法测磷，得出在模拟胃环境中植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量，对耐高温植酸酶的活性进行评估。
一种耐高温植酸酶活性评估方法，具体包括以下步骤：
一、高温处理：
(一)分别称取过40目筛的饲料样品3-5g，各置于铝塑袋中，分别作为处理组及空白组；
(二)将高温植酸酶加入到其中一个铝塑袋中，将两者充分混匀，空白组不加；
(三)将铝塑袋中饲料样品水分调至18％，插入一温度计密封；
(四)将处理好的铝塑袋放入提前预热的高压灭菌锅中，75℃-90℃反应3min，反应结束后迅速将铝塑袋取出置于冰水混合物中快速冷却至室温；
二、体外胃环境模拟消化：
将高温处理后的样品全部转移到碘量瓶中，加入到100mL-200mL胃蛋白酶盐酸溶液中，pH保持在3.0～3.5之间，严密封口，40℃恒温水浴摇床2h，冷却至室温后再测定溶液pH，pH应保持在4.0～4.5之间；
三、比色法测磷：准确移取碘量瓶中12mL上清液至离心管中4000rpm离心10min，并准确量取剩余上清液，离心后再准确移取离心管中1mL上清液至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，用分光光度计400nm比色测定，并在磷标准曲线上根据吸光光度值查出相应磷含量；
四、磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液各0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，再分别向其中加入10mL钒钼酸铵显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度，以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线；
五、结果计算：在模拟胃环境中植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：
上式中，P为植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量，mg/kg；m为饲料样品质量，g；C1为处理组饲料样品中磷的浓度，μg/mL；C2为空白组中饲料样品的浓度，μg/mL；V1为处理组碘量瓶中剩余上清液，mL；V2为空白组中剩余上清液，mL；
P≥0,植酸酶耐高温，P值越大，表明耐高温植酸酶活性越高。
进一步地，所述饲料样品由下列组分按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS10％。
进一步地，所述耐高温植酸酶为固态颗粒，酶活为5000～50000FYT/g。
进一步地，所述耐高温植酸酶按2,000FYT/kg的酶活添加量添加在所述铝塑袋中。
进一步地，所述胃蛋白酶盐酸溶液是将胃蛋白酶与盐酸溶液混合，混合后溶液的pH为2.0，胃蛋白酶的质量百分比浓度为0.2％，所述盐酸溶液为取0.83mL质量分数为36％的浓盐酸，定容至1000mL，pH为2.0。
进一步地，所述钒钼酸胺显色剂的配制具体步骤为：称取偏钒酸铵1.25g，加水200mL，加热溶解不能沸腾，冷却后加质量分数为65％的浓硝酸250mL溶解制成溶液A；另外称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，冷却，制成溶液B，将溶液A和溶液B混合，定容至1000mL。
进一步地，所述磷标准溶液的配制具体步骤为：取105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.2195g溶于蒸馏水中，加质量分数为65％的浓硝酸3mL，定容至1000mL。
与现有技术相比本发明的有益效果:
本发明提供的耐高温植酸酶活性评估方法，模拟实际生产中的制粒过程，以确定饲料生产中耐高温植酸酶的损失率，且本方法中各个参数与实际贴合较近，且在高温处理后立即对产品进行降温，减小了因后期试验各样品因测定时间不同而形成的误差，试验数据准确；模拟胃环境内底物释放水溶性磷含量来评估经胃内强酸、胃蛋白酶环境下植酸酶的有效利用率。通过整个试验综合评价耐高温植酸酶通过制粒等高温处理后在单胃动物胃中酶的实际活性。
附图说明
图1是本发明的磷标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体附图及实施例进一步详细说明本发明。
本发明实施例中的试验试材：
1、试验材料：耐高温植酸酶：固态颗粒，酶活为5000～50000FYT/g。
2、试验试剂和药品。
(1)胃蛋白酶盐酸溶液：将胃蛋白酶与盐酸溶液混合，混合后溶液的pH为2.0，胃蛋白酶的质量百分比浓度为0.2％。配制时须小心缓慢搅拌，防止胃蛋白酶失活。
(2)钒钼酸胺显色剂：称取偏钒酸胺1.25g，加水200mL加热溶解，冷却后再加入250mL质量分数为65％的浓硝酸，另称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容至1000mL，避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。
(3)磷标准液：将磷酸二氢钾在105℃干燥1h，在干燥器中冷却后称取0.2195g溶解于水，定量转入1000mL容量瓶中，加质量分数为65％的浓硝酸3mL，用水稀释至刻度，摇匀，即为50μg/mL的磷标准液。
(4)盐酸溶液：取0.83mL的浓盐酸(质量分数为36％)，定容至1000mL，pH为2.0。
(5)饲料样品：由下列组分按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS10％。粉碎后混合，40目全通。
3、仪器：手提式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)，恒温水浴摇床(上海浦东物理光学仪器SHZ-A)，低俗离心机(雷勃尔LD5-2B)，可见分光光度计721(上海菁华科技仪器有限公司)。
实施例1
一种耐高温植酸酶活性评估方法，具体包括以下步骤：
一、测定饲料样品实际含水量，具体测定方法参见GB/T 6435-2006。
二、耐高温植酸酶高温处理：
(一)分别称取饲料样品5g(精确至0.0001g)(m)，置于铝塑袋中，作为处理组和空白对照组,所述饲料样品由下列组分按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％、DDGS10％。
(二)将耐高温植酸酶按2,000FYT/kg的酶活添加量添加在其中一个所述铝塑袋中，即将2mg的酶活为5,000FYT/g的耐高温植酸酶(精确至0.1mg)加入到所述铝塑袋中(空白组不加)，使两者充分混合。
(三)将铝塑袋中样品水分调制18％，插入一温度计密封。
(四)将处理好的铝塑袋放入提前预热的高压灭菌锅中，80℃反应3min，反应结束后迅速将铝塑袋取出置于冰水混合物中快速冷却至室温。
三、耐高温植酸酶活性检验：将上述高温处理过的样品全部转移到碘量瓶中，加入到100mL胃蛋白酶盐酸溶液中(pH保持在3.0～3.5之间)，严密封口，40℃恒温水浴摇床2h，冷却至室温后再测定溶液pH，pH应保持在4.0～4.5之间(超出该范围则试验失败)，准确移取12mL上清液至离心管中(准确量取剩余上清液)，4000rpm离心10min，离心后再准确移取离心管中1mL上清液至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，用分光光度计400nm比色测定，并根据吸光光度值在磷标准曲线上查出相应磷含量。
四、磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液各0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，再分别加入10mL钒钼酸铵显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示；
五、结果计算：在模拟胃环境中植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：
上式中，P为耐高温植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量，mg/kg；m为饲料样品质量，g；C1为处理组饲料样品中磷的浓度，μg/mL；C2为空白组中饲料样品的浓度，μg/mL；V1为处理组碘量瓶中剩余上清液，mL；V2为空白组中剩余上清液，mL。
P≥0,说明植酸酶耐高温，P值越大，表明耐高温植酸酶活性越高。
六、试验结果
试验结果如表1所示，添加耐高温植酸酶后水溶性磷的释放量高于空白组，说明耐高温植酸酶经高温处理在体外模拟胃环境下仍具有活性，多释放的水溶性磷含量越高，说明耐高温植酸酶活性越高，经高温处理后的有效利用率越高。
表1耐高温植酸酶活性测定结果
实施例2
一种耐高温植酸酶活性评估方法，具体包括以下步骤：
一、测定饲料样品实际含水量，具体测定方法参见GB/T 6435-2006。
二、耐高温植酸酶高温处理：
(一)分别称取饲料样品3g(精确至0.0001g)(m)，各置于铝塑袋中，分别作为处理组和空白对照组,所述饲料样品由下列组分按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS10％。
(二)将耐高温植酸酶按2,000FYT/kg的酶活添加量添加在其中一个所述铝塑袋中，即将0.6mg的酶活为10000FYT/g的耐高温植酸酶(精确至0.1mg)加入到所述铝塑袋中(空白组不加)，使两者充分混合。
(三)将铝塑袋中样品水分调制18％，插入一温度计密封。
(四)将处理好的铝塑袋放入提前预热的高压灭菌锅中，90℃反应3min，反应结束后迅速将铝塑袋取出置于冰水混合物中快速冷却至室温。
三、耐高温植酸酶活性检验：将上述高温处理过的样品全部转移到碘量瓶中，加入到200mL胃蛋白酶盐酸溶液中(pH保持在3.0～3.5之间)，严密封口，40℃恒温水浴摇床2h，冷却至室温后再测定溶液pH，pH应保持在4.0～4.5之间(超出该范围则试验失败)，准确移取12mL上清液至离心管中(准确量取剩余上清液)，4000rpm离心10min，准确移取离心管中1mL上清液至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，用分光光度计400nm比色测定，并根据吸光光度值在磷标准曲线上查出相应磷含量。
四、磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液各0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，再分别加入10mL钒钼酸铵显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示；
五、结果计算：在模拟胃环境中植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：
上式中，P为耐高温植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量，mg/kg；m为饲料样品质量，g；C1为处理组饲料样品中磷的浓度，μg/mL；C2为空白组中饲料样品的浓度，μg/mL；V1为处理组碘量瓶中剩余上清液，mL；V2为空白组中剩余上清液，mL。
P≥0,说明植酸酶耐高温，P值越大，表明耐高温植酸酶活性越高。
六、试验结果
试验结果如表2所示，添加耐高温植酸酶后水溶性磷的释放量高于空白组，说明耐高温植酸酶经高温处理在体外模拟胃环境下仍具有活性，多释放的水溶性磷含量越高，说明耐高温植酸酶活性越高，经高温处理后的有效利用率越高。
表2耐高温植酸酶活性测定结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。