一种基于TAMFT‑3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记及其方法与流程

本发明涉及的是小麦分子育种的技术领域，尤其涉及的是一种基于TAMFT-3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记及其方法。

背景技术：

小麦在收获前遭遇连阴雨天气易发生穗发芽(Pre-harvest sprouting,PHS)。发生穗发芽的小麦产量下降，品质恶化，给种植者造成严重的经济损失。(Groos等，2002；Chang等，2010)。小麦穗发芽受内部遗传因素(如种皮颜色、种子休眠、淀粉酶、ABA、GA、小麦的穗部形态、籽粒吸水特性等)和外界环境因素(如光照、温度和湿度等)的共同影响(朱玉磊等，2014)。培育穗发芽抗性强的小麦品种是多雨麦区的重要育种目标。

小麦穗发芽抗性属于数量性状位点控制的遗传模式，前人定位出的穗发芽抗性相关QTL几乎遍布小麦21条染色体(Gao等，2013；Mares等，2014)，主要分布在小麦染色体2BS(Kulwal等，2004；Mohan等，2009；Munkvold等，2009)、3AS(Osa等，2003；Mori等2005；Kulwal等，2005；Imtiaz等，2008；Liu等，2008；Zhang等，2009；Liu等，2010；Nakamura等，2011；Graybosch等，2013)和4AL上(Anderson等，1993；Kato等，2001；Mares等，2001；Flintham等，2002；Lohwasser等，2005；Mares等，2005；Torada等，2005；Tan等，2006；Chen等，2008；Ogbonnaya等，2008；Rasul等，2009；Singh等，2010；Liu等，2011；Cabral等，2014)。上述主效位点的候选基因，如位于2BS的TaSdr、3AS的TaMFT、4AL的PM19-A1等(Zhang等，2014；Liu等，2013；Barrero等，2015)被相继克隆。

MFT(MOTHER OF FT AND TFL1)基因最初在拟南芥中被证明与种子萌芽有关，编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEPB(Xi等，2010)，是调控植物开花与延迟的FT与TFL1的同源物(Bradley等，1997；Kobayashi等，1999)。小麦中，Nakamura等(2011)和Liu等(2013)人利用基因芯片和RNAi技术先后证实TaMFT基因具有抑制小麦籽粒萌发的作用，与拟南芥中促进籽粒萌发的作用相反(Nakamura等，2011；Liu等，2013；Liu等，2015)，其中位于TaMFT基因启动子区域的1处SNP(-222)以及位于编码区的2处SNP(+646处、+666处)与穗发芽抗性/籽粒休眠显著相关(Nakamura等，2011；Liu等，2013；Liu等，2015)。Lei等(2013)在冬小麦中发现TAMFT-3A存在丰富的等位变异，其中编码区1处12bp的插入/缺失与穗发芽抗性紧密相关(Lei等，2013)。

小麦是异源六倍体，基因组庞大且复杂，单纯利用传统方法进行农艺性状的遗传改良效率不高，利用功能基因标记进行辅助选择可以提高育种的针对性，从而加速育种进程。目前，分子标记辅助选择已成功运用到小麦抗穗发芽育种中(Kottearachchi等，2006；Torada等，2008；Xiao等，2012)，但都是与目标性状紧密连锁的SSR分子标记。基因功能标记的应用可以显著提高分子标记辅助选择育种的效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于TAMFT-3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记及其方法，以基于TAMFT-3A基因基础上，开发一种新的功能标记，为小麦穗发芽抗性的分子鉴定提供一种新方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种基于TAMFT-3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记，所述TAMFT-3A基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第320、321位之间的33bp长度的插入/缺失序列，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明中，将该分子标记命名为TaMFT-A2。

本发明还提供了一种基于上述分子标记鉴定小麦穗发芽抗性的方法，包括以下步骤：

(1)提取小麦基因组DNA，以所述分子标记的上下游延伸序列为模板设计特异性扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)若上述步骤(1)的扩增产物包含所述分子标记，则小麦为抗穗发芽品种，其基因型记为TaMFT-A2a，若上述步骤(2)的扩增产物不包含所述分子标记，则小麦为感穗发芽品种，其基因型记为TaMFT-A2b。

进一步地，所述特异性扩增引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：上游引物F：GGCTACGTGTCGCTTGAC；

SEQ ID NO.4：下游引物R：GCGGCGGATTATTAACTG。

所述步骤(2)中，若扩增产物的长度为147bp，则小麦为抗穗发芽品种，若扩增产物的长度为114bp，则小麦为感穗发芽品种。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种基于TAMFT-3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记及其方法，该分子标记与小麦穗发芽抗性紧密相关，可用以开发一种新的鉴定小麦穗发芽抗性的功能标记，为小麦穗发芽抗性的分子鉴定提供了新的途径，为小麦穗发芽抗性的遗传育种提供了新的资源，丰富了小麦穗发芽抗性的遗传资源库，为小麦穗发芽抗性的遗传育种奠定基础。

附图说明

图1为TaMFT-A2标记检测9种小麦品种的琼脂糖电泳图；

图2为TaMFT-A2标记在安农0711/河农825重组自交系群体中的验证。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用种质资源，均可从国家种质资源库获得。

2、方法

2.1SDS-Tris饱和酚法抽提小麦基因组DNA

(1)分别取河农825，安农0711，周麦23，花培0616H-119，津农4，藁优9618，冀95-5219，石麦14，新麦19，共9种小麦品种的种子各2-3粒，置于2ml灭菌离心管，利用高通量组织研磨仪研磨成粉末，上述小麦品种可直接通过市场购买或从国家种质资源库获得。

(2)加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl，250mM NaCl,25mM EDTA,0.5％SDS,2％β-ME)。

(3)60℃水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。

(4)室温下12000rpm离心10min。

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25：24：1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

(6)室温下12000rpm离心10min。

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分去除蛋白。

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍异丙醇(300μl)和1/10倍体积(50μl)NaAc(pH5.2)，充分混合混匀后冰上静置17min，使DNA白色沉淀充分析出。

(9)4℃10000rpm离心10min。

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl其中含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解。

(11)在NanoVue Plus微量分光光度计上检测DNA浓度，并统一稀释成50ng/ul工作液，备用。

2.2引物设计

TAMFT-3A基因序列如SEQ ID NO.1所示，以目标分子标记所在位置的上下游延伸序列为模板，利用Primer Premier5.0软件设计特异性扩增引物，具体为：

SEQ ID NO.3：上游引物F：GGCTACGTGTCGCTTGAC；

SEQ ID NO.4：下游引物R：GCGGCGGATTATTAACTG。

2.3PCR扩增及检测

PCR扩增体系为10μL,包括10×buffer(含有2.0mmol·L^-1Mg²⁺)1.0μL，2.5mmol·L^-1dNTPs 0.8μL，5U·μL^-1Taq DNA polymerase 0.11μL，10μmol·L^-1引物各0.4μL，2.0μL模板DNA(50-60ngμL-1)，ddH₂O 5.29μL。PCR程序设定：94℃预变性5min，40个循环(94℃变性30S，56℃退火30S，每循环降0.1℃，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。产物利用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，GelStain荧光染料染色，BIO-RAD凝胶成像系统扫描拍照。

2.4结果分析

结果如图1所示，其中，M指Marker；1-9泳道对应的品种名称分别为：1：河农825，2：安农0711，3：周麦23，4：花培0616H-119，5：津农4，6：藁优9618，7：冀95-5219，8：石麦14，9：新麦19；图中，泳道2和9的条带略大于泳道1、3-8，说明泳道2、9对应的小麦品种(安农0711和新麦19)扩增产物包含所述分子标记，为TaMFT-A2a型，为抗穗发芽品种，泳道1、3-8对应的小麦品种扩增产物不包含所述分子标记，为TaMFT-A2b型，为感穗发芽品种。

将泳道1-9的扩增产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书提供的步骤进行回收。目标片段的连接使用pGEM-T Easy载体，连接体系为5μl的2×Rapid Ligation Buffer,、1μl的连接载体、1μl的T4连接酶和3μl的胶回收产物4℃过夜连接。取3μl连接后的载体通过42℃的热激法转化到Trans1-T1Phage Resistant大肠杆菌感受态细胞中，转化后的大肠杆菌涂在具有氨苄青霉素的LB培养基上，同时进行X-gal与IPTG的蓝白斑筛选。每个平板都挑选8个阳性克隆送去克隆测序，序列的测定由上海生工测序公司完成。测序结果为：泳道2、9对应的小麦品种扩增产物包含所述分子标记，泳道1、3-8对应的小麦品种扩增产物不包含所述分子标记，与上述琼脂糖凝胶电泳分析结果一致。

3、分子标记在连锁群体中的验证

取安农0711/河农825重组自交系群体，测定群体的种子萌芽指数，具体测定方法为：

于小麦蜡熟期分别收获小麦主茎穗材料，室内风干2天，立即存放于-20℃冰箱以维持种子的休眠性，待全部试验材料收获完毕，一并进行发芽试验。选取10个成熟期一致的主茎穗，手工脱粒，每个材料取50粒进行种子发芽试验，2次重复。籽粒腹沟朝下摆放在培养皿内，培养皿内加9ml无菌水，置于人工气候培养箱(20℃，光照14h，黑暗10h，湿度80％)，24小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数，于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子(以胚部露白为萌芽鉴定标准)，3天后计算种子萌芽指数(GI)。

种子萌芽指数(GI)计算公式：GI＝[(3×n1+2×n2+1×n3)/(3×N)]×100％

其中n1、n2、n3是种子第1天、第2天、第3天每天所萌芽的籽粒数，N指总粒数。

以安农0711/河农825重组自交系的F₅群体基因组DNA为模版，利用SSR引物(表1)进行PCR扩增，所述PCR扩增的体系为：总体积为10μL，包括10×buffer(含有2.0mmol·L^-1Mg²⁺)1.0μL，2.5mmol·L^-1dNTPs 0.8μL，5U·μL^-1Taq DNA polymerase 0.11μL，10μmol·L^-1引物各0.4μL，2.0μL模板DNA(50-60ngμL-1)，ddH2O 5.29μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；37个循环(94℃变性30s，50-62℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃延伸10min；4℃保存。用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。

表1：SSR引物序列

利用IciMapping 3.3软件(http://www.isbreeding.net)对安农0711/河农825重组自交系群体进行连锁图谱构建，遗传距离单位为cM，连锁标准为LOD值大于3.0，利用完备区间作图法对群体进行QTL定位，LOD值设为2.5。

结果如图2所示，图中可看出，TaMFT-3A的功能标记TaMFT-A2和7个SSR引物一起连锁在小麦3AS染色体上，且与Xbarc310紧密连锁，遗传距离为3.03cM。通过QTL分析，TaMFT-A2在安农0711/河农825的F₅群体中对穗发芽抗性表型的贡献率为15.03％，说明TaMFT-3A基因可能是该QTL区域的一个候选基因，33bp的插入/缺失导致穗发芽表型的变异。

4、分子标记在育种材料和中国微核心种质中的验证

取246份育种材料和265份中国微核心种质资源作为样品，分析两种等位类型TaMFT-A2a和TaMFT-A2b与穗发芽抗性的关系。其中：

样品种子萌芽指数(GI)的测定方法参照上文步骤3，在此不重复说明。

样品田间整穗发芽率(FS)的测定方法为：

小麦收获期间，遇到自然降雨天气，于田间保留10个小麦主茎穗进行自然降雨整穗发芽率测定。收获后置于电热恒温干燥箱中，150℃快速烘干，手工脱粒，统计发芽种子数和总粒数，计算田间整穗发芽率(field sprouting，FS)。

样品基因型的确定方法为：取TAMFT-3A基因启动子区域引物序列(CS3A06Proseq-F3：GTAGCGGGTGAAATCTGCAT；CS3A06Proseq-R5：GGGACGTACGAGGGTGTAGA)，进行PCR扩增，PCR扩增体系为10μL，包括10×buffer(含有2.0mmol·L^-1Mg²⁺)1.0μL，2.5mmol·L^-1dNTPs0.8μL，5U·μL^-1Taq DNA polymerase 0.11μL，10μmol·L^-1引物各0.4μL，2.0μL模板DNA(50-60ngμL-1)，ddH₂O 5.29μL。反应程序为98℃预变性30s；40个循环(98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃延伸10min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，目标产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书提供的步骤进行回收。目标片段的连接使用pGEM-T Easy载体，连接体系为5μl的2×Rapid Ligation Buffer,、1μl的连接载体、1μl的T4连接酶和3μl的胶回收产物4℃过夜连接。取3μl连接后的载体通过42℃的热激法转化到Trans1-T1Phage Resistant大肠杆菌感受态细胞中，转化后的大肠杆菌涂在具有氨苄青霉素的LB培养基上，同时进行X-gal与IPTG的蓝白斑筛选。每个平板都挑选8个阳性克隆送去克隆测序，序列的测定由上海生工测序公司完成。

结果如下表2、3所示：

表2：246份小麦育种材料中TaMFT-A2不同等位变异与穗发芽抗性的相关性分析

注：**表示在0.01水平上差异显著；*表示在0.01水平上差异显著

表3：265份中国微核心种质中TaMFT-A2不同等位变异与穗发芽抗性的相关性分析

注：**表示在0.01水平上差异显著；*表示在0.01水平上差异显著

表中可看出，携带TaMFT-A2a等位类型的材料具有较低的发芽指数(GI)，即较高的穗发芽抗性，而携带TaMFT-A2b等位类型的材料则具有较高的发芽指数(GI)，即较低的穗发芽抗性。其中TaMFT-A2a等位类型在246份育种材料中与2012-2015共4年的种子萌芽指数(GI)以及2013和2015两年的田间穗发芽率(FS)均呈极显著负相关(相关系数为0.172**-0.312**)，在265份中国微核心种质中，该等位类型与2014-2016共3年的GI以及2015年的FS呈显著或极显著负相关(相关系数为0.140*-0.250**)。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 一种基于TAMFT-3A基因的鉴定小麦穗发芽抗性的分子标记及其方法

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 685

<212> DNA

<213> 小麦河农825

<400> 1

actgtgtgag aaagaaaaaa cccagactaa ggaagtgcat gcatctggct cggcgagtga 60

ttgtaaacaa ctggctcact gcattgcatg cgtacatgca tgcgcagtac acacgcagac 120

gcagctggtg gatccagcca gcggattgtc tgtctcgctg gcgggagagg cacgcagtac 180

gcacccagat catcacccca cacgtggcac gccggtcctt ccagaggcca tgtcccggct 240

acgtgtcgct tgacctgtac atgcatgatc catgcacgca tcagcgatcg atacgtatgc 300

gtaggctgca tgcacgcatg gtgacaaaac cctcagttaa taatccgccg cgctagccac 360

ctgcttagcg taagccatat atacacccag ccatgcgtca tttgtacagg tcgtcgttgg 420

ctctcgtcca gagaaaagca ggggaagaca aggagaaaag agcagagcag aggagcaaac 480

atgtcccggt tcgttgatcc gctggtggtg gggcgggtga tcggcgaggt ggtggacatg 540

ttcgtgccgt cggtggccat ggccgtggcc tacggcgcca gggacctcag caacggctgc 600

cacgtgaagc cctccctggc cgccgaccag ccgctcgtcc gcatctccgg ccgccgcaac 660

gacctctaca ccctcgtacg tccca 685

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 小麦

<400> 2

gcgccaagga gggtagccca agtcccaacc ccc 33

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggctacgtgt cgcttgac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggcggatt attaactg 18