本发明涉及一种采用微生物发酵法制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，特别是一种单水相系统发酵转化2,2-二甲基环丙烷甲氰制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺，英文名称：(S)-(+)-2,2-Dimethylcyclopropanecarboxamide，是合成西司他丁的中间体，在西司他丁的合成中有着重要的作用。现有技术中，(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的合成采取的生产工艺主要是：甘氨酸乙酯盐酸盐经重氮化反应制得重氮乙酸乙酯，与异丁烯在自制的手性催化剂—（R,R）-(+)-2,2＇-亚异丙基双(4-叔丁基-2-噁唑啉)与三氟甲磺酸亚铜的络合物催化下进行不对称环丙烷化反应，制得(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，碱性条件下水解，再与氯化亚砜反应得到酰氯后氨解制得(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺。该制备方法存在的缺陷是制备成本高、生产周期长、污染环境。为此，寻找一种操作简单、制备周期短，环境友好的制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，成为现阶段该领域研究的热点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种采用微生物发酵法制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，以解决现有的化学方法制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中存在的产物收率低且环境污染严重的问题。
本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的。一种采用微生物发酵法制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，包括以下步骤：
（1）菌种繁殖
将赤红球菌菌种接入种子培养基中培养，菌种繁殖的条件为：将浓度109-1010个/ml的赤红球菌菌种以0.1%-0.2%的接种量接入装有种子培养基的培养罐中培养；
（2）发酵培养
待步骤（1）中的菌种培养基OD600为20-30，培养时间36-44小时，
pH5.5-6.0时，以5%-10%的接种量将其接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，培养温度为25-30℃；
（3）细胞分离
将步骤（2）得到的发酵液进行培养基分离，除去培养基，得到菌体；
（4）转化原料
将菌体用30-50倍发酵液体积的纯水混匀后逐滴加入2,2-二甲基环丙烷甲氰，控制反应温度25℃-28℃，滴加中维持2,2-二甲基环丙烷甲氰浓度小于10g/L，转化结束后检测2,2-二甲基环丙烷甲氰浓度低于0.2g/L，则反应结束，得到S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺和菌体的混合液；
（5）成品提取
用至少2倍量的氯仿或丙酮对上述混合液依次进行萃取、过滤、脱色、蒸馏得到粗品，粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次进行萃取、脱色、过滤、蒸馏，然后加入至少2倍量己烷或者甲苯后进行蒸馏结晶得到精制品。
优选的，步骤（1），种子培养基中各组分浓度：葡萄糖 10-15g/L、K2HPO4 0.3-0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.3-0.6g/L、磷酸二氢钾 0.3-0.6g/L、尿素5.0-10g/L、味精 0.05-0.2g/L，酵母膏5-8g/L、种子培养基的pH为6.0-7.0。
优选的，步骤（2），发酵培养基中各组分浓度：葡萄糖 30-40g/L， K2HPO410-15g/L，MgSO4·7H2O 15-20g/L，KH2PO410-15g/L，尿素10-15g/L，味精1.0-3.0g/L，酵母膏5-10g/L，发酵培养基的pH为6.0-7.0。
优选的，步骤（3），细胞分离培养基采用超滤膜，即中空玻璃纤维膜分离，这样可以连续操作除去培养基，操作时间短，生产效率高，并且保证细胞分离过程中不会被破坏。
本发明取得的有益效果如下：
提高了2,2-二甲基环丙烷甲腈的利用率，发酵底物转化率达到35%以上。
发酵中采用单水相体系且提取操作中溶媒种类少，用量小，环境污染小，成本低，降低了成品提取的难度，操作简单，环境友好。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。需要指出的是，所给出的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺及烟酰胺的方法，包括如下步骤：
（1）菌种繁殖
将浓度107个/ml的耻垢分枝杆菌菌种以2%的接种量接入装有种子培养基的培养罐中培养，种子培养基中包括如下浓度的组分：葡萄糖 12g/L、磷酸氢二钾 0.5g/L、硫酸镁·7H2O 0.5g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、尿素8g/L、味精 0.1g/L，酵母膏6g/L、种子培养基的pH为6.0-7.0。
（2）发酵培养
待步骤（1）中的菌种培养基OD600为30时，以10%的接种量将其接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；
发酵培养的条件为：温度25℃，发酵初始pH 6.0，溶氧量40%，培养转速200rpm，培养周期44h。
（3）细胞分离
采用膜过滤，大约用水量为发酵液量体积的4-5倍体积将培养基除去，得到细胞。
（4）底物转化
将步骤（3）中得到的菌体与30-50倍体积的纯水混匀，而后逐滴加入2,2-二甲基环丙烷甲氰，保证底物浓度低于10 g/L，滴加温度在25-28℃，滴加完成后检测2,2-二甲基环丙烷甲氰浓度低于0.1g/L，则反应结束，得到S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺和菌体的混合液。
（5）成品提取
用4-6倍量的氯仿将所述混合液依次进行萃取、脱色、过滤、蒸馏得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次进行脱色、过滤、蒸馏，然后加入4倍量的甲苯后进行蒸馏结晶得到精制品。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为39.0%，最终效价15.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量 99.40%。
实施例2
将实施例1中的滴加温度改为在30℃，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为36.3%，最终效价14.5g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例3
将实施例1发酵罐的接种量改为15%，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为39.3%，最终效价15.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例4
将实施例1中将转化底物的浓度改为20 g/L，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为30.6%，最终效价12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例5
将实施例1中发酵培养条件中溶氧量更改为20%，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为32.6%，最终效价13g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例6
将实施例1中发酵培养条件中溶氧量更改为30%，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为36.6%，最终效价14.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例7
将实施例1中发酵培养条件中溶氧量更改为40%，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为40.6%，最终效价16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例8
将实施例1中发酵培养条件中pH值更改为5.0-5.5，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为33.6%，最终效价13.4g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例9
将实施例1中发酵培养条件中pH值更改为5.5-6.0，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为40.6%，最终效价16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例10
将实施例1中发酵培养条件中pH值更改为6.0-6.5，其余操作与实施例1相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为39.6%，最终效价15.8g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例11
将实施例1中发酵培养条件中pH值更改为7.0-8.0，其余操作与实施例2相同。
测试结果：2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为30.6%，最终效价12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
综合分析实施例1、实施例5至实施例11，可见发酵培养的合适pH为弱酸性或中性环境；最合适的溶氧控制为30%-40%；最合适的发酵温度为27-29℃；最合适的发酵接种量10%；转化底物浓度控制低于10g/L；转化温度控制在24-28℃。
实施例12
单水相系统发酵转化2,2-二甲基环丙烷甲氰，制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的方法，包括如下步骤：
（1）菌种繁殖
将浓度1011个/ml的赤红球菌菌种以2%的接种量接入装有种子培养基的培养罐中培养，种子培养基中包括如下浓度的组分：葡萄糖12g/L，酵母膏6.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸镁0.4g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,磷酸二氢钾0.4g/L, PH值为6.5～7.0；
种子罐培养的条件为：温度28±0.5℃，发酵初始pH 为7.0，溶氧量40%，培养转速250rpm，培养周期36h；
（2）发酵培养
待步骤（1）中的菌种培养基OD600为30时，以10%的接种量将其接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；
发酵培养基中包括如下浓度的组分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸镁2g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,磷酸二氢钾1.5g/L,诱导剂3ppm， PH值为6.5～7.0。
发酵培养的条件为：温度28℃，发酵初始pH 为7.0，溶氧量30%，培养转速180rpm，培养周期100h；
（3）细胞分离
将步骤（2）得到的发酵液分理处细胞，具体操作为采用连续膜过滤系统，用4-5倍体积的水洗，除去培养基，得到细胞。
（4）底物转化
将步骤（3）得到的细胞，与30-50倍体积的纯水混匀，而后开始滴加转化的底物。逐滴加入2,2-二甲基环丙烷甲氰，保证原料浓度低于10 g/L，滴加温度在25-28℃，滴加完成后，检测2,2-二甲基环丙烷甲氰浓度低于0.1g/L，反应结束，得到混合溶液。
（5）成品提取
用4-6倍量的氯仿将上述混合溶液依次进行萃取、脱色、过滤、蒸馏得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次进行脱色、过滤、蒸馏，然后加入4倍量的甲苯后进行蒸馏结晶得到精制品。
测试结果： 2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为33.1%，最终效价13.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
实施例13
单水相系统发酵转化底物制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺及烟酰胺的方法，包括如下步骤：
（1）菌种繁殖
将浓度1010个/ml的赤红球菌菌种以3%的接种量接入装有种子培养基的培养罐中培养，种子培养基中包括如下浓度的组分：葡萄糖12g/L，酵母膏7.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸镁0.4g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,磷酸二氢钾0.4g/L, PH值为6.5～7.0；
种子罐培养的条件为：温度28±0.5℃，发酵初始pH 为6.5，溶氧量45%，培养转速250rpm，培养周期36h；
（2）发酵培养
待步骤（1）中的菌种培养基OD600为30时，以10%的接种量将其接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；
发酵培养基中包括如下浓度的组分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸镁2g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,磷酸二氢钾1.5g/L,诱导剂3ppm， PH值为6.5～7.0。
发酵培养的条件为：温度28℃，发酵初始pH 为7.0，溶氧量30%，培养转速180rpm，培养周期100h；
（3）细胞分离
将步骤（2）得到的发酵液分理处细胞，具体操作为采用连续膜过滤系统，用4-5倍体积的水洗，除去培养基，得到细胞。
（4）底物转化
将步骤（3）得到的细胞，与30-50倍体积的纯水混匀，而后开始滴加转化的底物。逐滴加入2,2-二甲基环丙烷甲氰，保证底物浓度低于10 g/L，滴加温度在25℃-28℃，滴加完成后，检测2,2-二甲基环丙烷甲氰浓度低于0.1g/L,则反应完全，得到混合溶液。
（5）提取
用4-6倍量的氯仿将所述滤饼溶解后依次进行萃取、脱色、过滤、蒸馏得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次进行脱色、过滤、蒸馏，然后加入4倍量的甲苯后进行蒸馏结晶得到精制品。
测试结果： 2,2-二甲基环丙烷甲氰的转化率为34.2%，最终效价13.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。