T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞。

背景技术：

T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)，是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4多聚核苷酸激酶可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5'-P+NDP→5'-OH+NTP(最适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时，T4多聚核苷酸激酶可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5'-P+NTP+NDP→5'-P+NDP+NTP。

T4 PNK同时具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P→3'-OH+Pi(最适pH为5.9左右)。

T4 PNK的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。

T4 PNK应用广泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接；去除3'端磷酸基团。

作为常用的分子生物学试剂，T4 PNK市场需求量巨大，目前基因工程技术克隆的重组T4多聚核苷酸激酶在pET系统中表达量高，但是存在如下问题：无可溶性标签时易表达形成包涵体，通过包涵体复性可得到少量的活性蛋白，但是保存过程中蛋白易聚集形成聚体，形成沉淀，稳定性较差；增加可溶性标签可提高可溶性蛋白的比例，但是纯化后的蛋白活性较低，若去除标签成本较高且得到的活性蛋白稳定性较差。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种稳定性较好并且活性较高的T4多聚核苷酸激酶重组酶。

此外还有必要提供上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞。

一种T4多聚核苷酸激酶重组酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、和由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。

一种表达基因，包括：

(a)、编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(b)、和编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖内切酶活性；或

(d)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％的同源性。

一种表达基因，包括：

(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(b)、和编码由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；或

(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加。

一种表达载体，包括上述的表达基因。

在一个实施例中，所述表达载体为pET-28a。

一种宿主细胞，包括上述的基因表达载体，所述宿主细胞为原核生物细胞。

在一个实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在一个实施例中，所述宿主细胞为BL21。

一种T4多聚核苷酸激酶重组酶的制备方法，包括如下步骤：

提供上述的宿主细胞，诱导表达后收集表达完成后的宿主细胞；

对所述表达完成后的宿主细胞进行裂解后离心，保留上清液；以及

将所述上清液纯化后得到所述T4多聚核苷酸激酶重组酶。

在一个实施例中，所述诱导表达的操作中，表达温度为16℃～20℃、诱导剂的终浓度为0.2mM～0.5mM，诱导表达的时间为12h～24h。

这种T4多聚核苷酸激酶重组酶通过基因工程技术重组得到，经过表达后检测发现，这种T4多聚核苷酸激酶重组酶的稳定性较好并且活性较高。

附图说明

图1为实施例2中重组T4 PNK蛋白的SDS-PAGE(12％)分析图，其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1和泳道2为诱导前，泳道3和4为诱导后的全菌蛋白表达，蛋白Marker分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18.4kDa和14.4kDa；

图2为实施例2中重组T4 PNK的SDS-PAGE(12％)分析图，其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为原酶，泳道2为原酶稀释5倍，泳道3为原酶稀释10倍，泳道4为原酶稀释20倍；

图3为实施例2中重组T4 PNK和NEB-T4 PNK的活力对比SDS-PAGE(12％)分析图，其中，用到M为Marker，泳道1为100U，泳道2为200U，泳道3为400U，泳道4为600U。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明公开了一种T4多聚核苷酸激酶重组酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、和由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。

这种T4多聚核苷酸激酶重组酶通过基因工程技术重组得到，经过表达后检测发现，这种T4多聚核苷酸激酶重组酶的稳定性较好并且活性较高。

本发明还公开了一实施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因，包括如下：

(a)、编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(b)、和编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖内切酶活性；或

(d)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％的同源性。

本发明还公开了另一实施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因，包括如下：

(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(b)、和编码由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；或

(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加。

本发明还公开了一实施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达载体，包括上述的表达基因。

优选的，表达载体为pET-28a。

本发明还公开了一实施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的宿主细胞，包括上述的基因表达载体，宿主细胞为原核生物细胞。

优选的，宿主细胞为大肠杆菌。

更优选的，宿主细胞为大肠杆菌为BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)。

本发明还公开了一实施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的制备方法，包括如下步骤：

S10、提供上述的宿主细胞，诱导表达后收集表达完成后的宿主细胞。

宿主细胞可以通过如下操作制得：采用基因工程技术，通过重组T4 PNK原核表达载体构建，成功将密码子优化后的T4 PNK基因克隆至带有His标签的pET载体中，构建了含有上述T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因的pET载体，测序结果正确后将上述含有T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因的pET载体转化到宿主细胞中，并保存在甘油中。

诱导表达的操作中，表达温度为16℃～20℃(优选为18℃)、诱导剂的终浓度为0.2mM～0.5mM(优选为0.25mM)，诱导表达的时间为12h～24h(优选为16h)。

诱导表达后离心，保留沉淀即为表达完成后的宿主细胞。

S20、对S10得到的表达完成后的宿主细胞进行裂解后离心，保留上清液。

S20具体为：将表达完成后的宿主细胞用冰浴的裂解缓冲液悬浮、混匀后，冰浴超声裂解细胞，离心并保留上清液。

裂解缓冲液包括50mM Tris、1.5M NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和20mM Imidazole(咪唑)，裂解缓冲液的pH为7.5。

S30、将S20得到的上清液纯化后得到T4多聚核苷酸激酶重组酶。

S30具体为：上清液通过裂解缓冲液平衡的Ni柱，上样完成后用裂解缓冲液充分平衡，再用预洗缓冲液充分洗涤；进一步用洗脱缓冲液洗脱蛋白，Ni亲和层析已经除去了绝大不部分的杂蛋白，离子交换可除去痕量杂蛋白和核酸。

预洗缓冲液包括50mM Tris、0.5M NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100和100mM Imidazole，预洗缓冲液的pH为7.5。

洗脱缓冲液包括50mM Tris、500mM NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100和0.5M Imidazole，洗脱缓冲液的pH为7.5。

通过载体构建将T4 PNK的基因克隆到pET载体中，在低温条件下诱导表达，利用低温、低IPTG浓度提高表达蛋白的可溶比例，利用高盐裂解缓冲液提高表达蛋白的可溶比例，最终使表达蛋白的可溶性大大增加。另外由于His标签的加入使T4 PNK的纯化更加简单、方便。

这种T4多聚核苷酸激酶重组酶通过基因工程技术重组得到，经过表达后检测发现，这种T4多聚核苷酸激酶重组酶的稳定性较好并且活性较高。

以下为具体实施例。

实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例1、重组T4 PNK的表达和纯化

采用基因工程技术，通过重组T4 PNK原核表达载体构建，成功将密码子优化后的T4 PNK基因克隆至带有His标签的pET载体中，构建了含有T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因(序列如SEQ ID No.2所示)的pET载体，测序结果正确后将上述含有T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达基因的pET载体转化到BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)中，得到菌种并保存在甘油中。

将100μL上述菌种接种至含50mg/mL卡纳青霉素的10mLLB培养基中；培养2-3小时待菌液长至OD600为1.0左右，将菌液分别5mL转接入2瓶含50mg/mL卡纳青霉素的500mL LB培养基中，继续培养3-4小时待菌液长至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导T4 PNK表达过夜；将表达温度控制在18℃，诱导16个小时后收集菌体细胞。1L菌液于400mL离心杯中7000rpm，4℃离心3min收集菌体。

收集1L的菌体细胞，用100mL冰浴的裂解缓冲液悬浮、混匀，裂解缓冲液含50mM Tris，1.5M NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，0.2mM PMSF，pH7.5，20mM Imidazole；冰浴超声裂解细胞(留样40μL菌体破碎全液)，离心取上清(留样40μL菌体破碎上清)，沉淀用等体积裂解缓冲液重悬混匀(留样40μL菌体破碎沉淀)。裂解上清通过裂解缓冲液平衡的Ni柱，收集流穿液(留样40μL Ni-穿过)；上样完成后用裂解缓冲液充分平衡，收集流穿液(留样40μL Ni-平衡)；再用预洗缓冲液充分洗涤，预洗缓冲液含50mM Tris，0.5M NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，pH7.5，100mM Imidazole，收集流穿液(留样40μL Ni-预洗)；进一步用洗脱缓冲液洗脱蛋白，洗脱缓冲液含50mM Tris，500mM NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，0.5M Imidazole，pH7.5，收集流穿液(留样40μL Ni-洗脱)，得到重组T4 PNK。Ni亲和层析已经除去了绝大部分的杂蛋白，离子交换可除去痕量杂蛋白和核酸。

实施例2、SDS-PAGE(12％)蛋白电泳验证T4 PNK蛋白大小和纯度

将实施例1得到的重组T4 PNK进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，鉴定重组T4 PNK的大小和纯度。

(1)取样品各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，同蛋白Marker一起上样各5μL，浓缩胶恒压100V，分离胶恒压180V，考马氏亮蓝染色，得到图1。

(2)将T4 PNK原酶液分别稀释5倍、10倍、20倍，将稀释后酶液及原酶液各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，上样10μL，浓缩胶恒压100V，分离胶恒压180V，考马氏亮蓝染色，得到图2。

(3)以NEB的商品化T4 PNK(NEB-T4 PNK)为对比，将实施例1制得的得到的重组T4 PNK和NEB-T4 PNK分别梯度稀释，取样品各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，同蛋白Marker一起上样各5μL，浓缩胶恒压100V，分离胶恒压180V，考马氏亮蓝染色，得到图3。

SDS-PAGE(12％)分析结果表明：

(1)请参考图1，各电泳条带在浓缩胶中被压成一条直线；从图1中条带位置，结合测序结果初步判断，重组T4 PNK大小正确；18℃、0.25mM IPTG诱导，重组T4 PNK表达量可达到10％以上，可溶性可达到80％以上。

(2)Ni亲和层析已经除去了绝大部分的杂蛋白，离子交换可除去痕量杂蛋白和核酸。

(3)请参考图2，比较原酶中杂带与稀释后主带的强度。若原酶中杂带强度<稀释后主带的强度，则重组T4 PNK纯度大于95％，胶面背景干净，样品条带清晰，纯度合格。由图2可以看出，纯化得到的重组T4 PNK的分子量在35kDa左右，蛋白纯度大于95％。

(4)请参考图3，实施例1得到的重组T4 PNK表现出的酶活力与NEB的商品化酶相近，比活约为10U/μg。

(5)1L的发酵液可得到约1L的10U/μL T4 PNK工作液。

实施例3、重组T4 PNK酶的活性测定

重组T4 PNK酶的活性测定采用[γ-³²P]ATP掺入法进行定量分析，具体流程参考文献：Richardson,C.C.(1971)Procedures in Nucleic Acids Res.,2,815-826

活性定义为：以Micrococcal Nuclease处理的小牛胸腺DNA为底物，在37℃，pH7.6的条件下，30分钟内使1nmol的[γ-³²P]ATP掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位(unit)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 菲鹏生物股份有限公司

<120> T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 301

<212> PRT

<213> T4多聚核苷酸激酶重组酶

<400> 1

Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Ile Gly Cys Pro Gly Ser Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Trp Ala Arg Glu Phe Ile Ala Lys Asn Pro Gly Phe Tyr Asn Ile

20 25 30

Asn Arg Asp Asp Tyr Arg Gln Ser Ile Met Ala His Glu Glu Arg Asp

35 40 45

Glu Tyr Lys Tyr Thr Lys Lys Lys Glu Gly Ile Val Thr Gly Met Gln

50 55 60

Phe Asp Thr Ala Lys Ser Ile Leu Tyr Gly Gly Asp Ser Val Lys Gly

65 70 75 80

Val Ile Ile Ser Asp Thr Asn Leu Asn Pro Glu Arg Arg Leu Ala Trp

85 90 95

Glu Thr Phe Ala Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Val Glu His Lys Val Phe

100 105 110

Asp Val Pro Trp Thr Glu Leu Val Lys Arg Asn Ser Lys Arg Gly Thr

115 120 125

Lys Ala Val Pro Ile Asp Val Leu Arg Ser Met Tyr Lys Ser Met Arg

130 135 140

Glu Tyr Leu Gly Leu Pro Val Tyr Asn Gly Thr Pro Gly Lys Pro Lys

145 150 155 160

Ala Val Ile Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg

165 170 175

Gly Pro Tyr Asp Leu Glu Lys Cys Asp Thr Asp Val Ile Asn Pro Met

180 185 190

Val Val Glu Leu Ser Lys Met Tyr Ala Leu Met Gly Tyr Gln Ile Val

195 200 205

Val Val Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Lys Glu Asp Pro Thr Lys Tyr

210 215 220

Tyr Arg Met Thr Arg Lys Trp Val Glu Asp Ile Ala Gly Val Pro Leu

225 230 235 240

Val Met Gln Cys Gln Arg Glu Gln Gly Asp Thr Arg Lys Asp Asp Val

245 250 255

Val Lys Glu Glu Ile Phe Trp Lys His Ile Ala Pro His Phe Asp Val

260 265 270

Lys Leu Ala Ile Asp Asp Arg Thr Gln Val Val Glu Met Trp Arg Arg

275 280 285

Ile Gly Val Glu Cys Trp Gln Val Ala Ser Gly Asp Phe

290 295 300

<210> 2

<211> 906

<212> DNA

<213> T4多聚核苷酸激酶重组酶的表达序列

<400> 2

atgaaaaaga ttattttgac tattggctgt cctggttctg gtaagagtac ttgggctcgt 60

gaatttattg ctaagaatcc cgggttttat aatatcaatc gtgatgacta tcgccaatct 120

attatggcgc atgaagaacg cgatgagtac aagtatacca aaaagaaaga aggtatcgta 180

actggtatgc agtttgatac agctaaaagt attctgtacg gtggcgattc tgttaaggga 240

gtaatcattt cagatactaa cctgaatcct gaacgtcgcc tagcatggga aacttttgcc 300

aaagaatacg gctggaaagt tgaacataaa gtgtttgatg ttccttggac tgaattggtt 360

aaacgtaact caaaacgcgg aactaaagca gtaccaattg atgttttacg ttcaatgtat 420

aaaagcatgc gagagtatct cggtcttcca gtatataatg ggactcctgg taaaccaaaa 480

gcagttattt ttgatgttga tggtacacta gctaaaatga atggtcgtgg tccttatgac 540

cttgaaaaat gcgataccga tgttatcaat cctatggttg ttgaactgtc taagatgtat 600

gctcttatgg gttatcaaat cgtagtcgtt tcaggtcgtg aaagtggaac taaagaagac 660

ccaacgaaat attatcgtat gacccgtaaa tgggttgagg acattgctgg cgttccatta 720

gttatgcaat gtcagcgcga acaaggcgat acccgtaaag acgatgtagt taaagaagaa 780

attttctgga aacacattgc accgcatttt gacgtgaaat tagctattga tgaccgaact 840

caagtagttg aaatgtggcg tcgtatcggt gttgaatgct ggcaagtcgc ttcgggagat 900

ttttaa 906