一种纳米荧光微球的制备方法与流程

本发明涉及一种纳米荧光微球的制备方法。

背景技术：

荧光微球，一般指直径在纳米级别到微米级别的带有荧光光学性能的一种聚合物微球。其荧光性能来自于表面吸附或微球内部包埋的荧光物质，受外界能量激发而发出荧光。其荧光性能由荧光染料自身结构所决定，并受到外界因素的影响。在适当条件下可制备得到形态结构稳定，尺寸均匀，发光高效而稳定的荧光微球。相较于传统荧光染料，荧光微球可具有良好的水溶性及生物相容性，这使其在生物医学方面受到广泛关注。

荧光微球的制备主要包括物理吸附，包埋，自组装等方法。物理吸附法一般是将非水溶性的荧光染料分散在水溶性有机溶剂中，再将其与微球载体的水分散体系混合，由于荧光染料在水溶液中的分散性较差，便会析出吸附到微球表面或接枝到聚合物微球表面。包埋法是将荧光物质分散在含有聚合物单体的介质中，利用聚合反应制备聚合物微球的同时，将荧光物质包埋到聚合物微球内部，一般制备出的荧光微球具有明显的核-壳结构。

近年来，荧光技术在高通量药物筛选及医学标记中受到广泛研究与应用，极大的促进了对荧光微球研究的深入。在该方面，我国长期依赖进口，而一些自助研发的产品又存在诸多问题，例如成本过高，价格昂贵，无法大规模生产，质量不稳定等问题。因此能使聚合物荧光微球国产化，量产化，对我国生物医学等各个领域的发展具有十分重大的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种纳米荧光微球的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：一种纳米荧光微球的制备方法，包括以下步骤：

a、荧光染料溶液的配置：将荧光染料溶于有机溶剂，通过稀释获得荧光染料溶液；

b、纳米荧光微球的制备：将共聚单体、引发剂、交联剂、分散剂、分散介质和荧光染料溶液加入反应容器中，搅拌分散均匀，反应，制得纳米荧光微球溶液；

c、纳米荧光微球溶液的透析：对纳米荧光微球溶液进行透析处理，除去未反应的单体及杂质。

进一步地，步骤a中荧光染料溶液的配置过程具体为：荧光染料是使用Suzuki偶联法制备的共轭聚合物染料：聚取代三苯胺-芴-苯并噻二唑，先用三氯甲烷作为溶剂溶解荧光染料配成质量比为3‰的溶液，再通过稀释获得质量百分比为0.005～0.006％的荧光染料溶液。

进一步地，步骤b中纳米荧光微球的制备过程具体为：称取共聚单体、交联剂、分散剂、分散介质、荧光染料溶液，搅拌分散均匀，加热至40℃，使用恒压低液漏斗滴加引发剂反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

进一步地，交联剂的量为共聚单体质量的7～9％，分散剂的量为共聚单体质量的5～7％，分散介质的量为共聚单体质量的25～50ml/g，荧光染料溶液的量为共聚单体质量的7.5ml/g，引发剂的量为共聚单体质量的5％。

进一步地，共聚单体为N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：3～3：1。

进一步地，交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，引发剂为过硫酸铵，分散剂为十二烷基磺酸钠，分散介质为蒸馏水。

进一步地，步骤c中荧光微球溶液的透析过程具体为：剪取经过处理的透析袋8～10cm，加入步骤b中得到的纳米荧光微球溶液，两端封口，放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

本发明的有益效果是：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DMC)都具有良好的水溶性，使用其制备的聚合物微球也具有良好的水溶性。同时，NIPAM作为一种温敏性材料，在合成微球的材料中加入NIPAM，也可以为产物带来一定的温敏性能。实验研究了温度的不断变化对荧光微球荧光性能的影响。NIPAM和DMC都是生物亲和性的试剂，使用这两种单体共聚包埋荧光染料制备的荧光微球具有良好的生物相容性，可以与细胞共同生长而不影响细胞活性，可以很好的应用于生物体内细胞标记、示踪，免疫分析，基因研究等。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是荧光纳米微球的红外及紫外吸收图，其中，A为共聚单体、荧光染料、实施例1制备的荧光微球的红外谱图，B为荧光染料、实施例2、3制备的荧光微球的紫外吸收图；

图2是温度的变化对微球荧光性能的影响图，其中，温度依次为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、55℃。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

称取0.1g NIPAM、0.3g DMC、0.02g十二烷基磺酸钠(SDS)(5％)、0.028g N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)(7％)，加入三口烧瓶中，加入15ml蒸馏水，加入3ml浓度为0.005％的荧光染料溶液，搅拌使其分散均匀。升高温度至40℃，将0.02g过硫酸铵溶于4～5ml蒸馏水中，使用恒压低液漏斗缓慢滴加进三口烧瓶中并引发反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

剪取8～10cm经过处理的透析袋，加入通过上述步骤得到荧光微球的溶液，两端封口。放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

实施例2

称取0.2g NIPAM、0.2g DMC、0.02g SDS(5％)、0.028g MBA(7％)，加入三口烧瓶中，加入15ml蒸馏水，加入3ml浓度为0.005％的荧光染料溶液，搅拌使其分散均匀。升高温度至40℃，将0.02g过硫酸铵溶于4～5ml蒸馏水中，使用恒压低液漏斗缓慢滴加进三口烧瓶中并引发反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

剪取8～10cm经过处理的透析袋，加入通过上述步骤得到荧光微球的溶液，两端封口。放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

实施例3

称取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.02g SDS(5％)、0.028g MBA(7％)，加入三口烧瓶中，加入15ml蒸馏水，加入3ml浓度为0.005％的荧光染料溶液，搅拌使其分散均匀。升高温度至40℃，将0.02g过硫酸铵溶于4～5ml蒸馏水中，使用恒压低液漏斗缓慢滴加进三口烧瓶中并引发反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

剪取8～10cm经过处理的透析袋，加入通过上述步骤得到荧光微球的溶液，两端封口。放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

实施例4

称取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.024g SDS(6％)、0.028g MBA(7％)，加入三口烧瓶中，加入15ml蒸馏水，加入3ml浓度为0.005％的荧光染料溶液，搅拌使其分散均匀。升高温度至40℃，将0.02g过硫酸铵溶于4～5ml蒸馏水中，使用恒压低液漏斗缓慢滴加进三口烧瓶中并引发反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

剪取8～10cm经过处理的透析袋，加入通过上述步骤得到荧光微球的溶液，两端封口。放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

实施例5

称取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.02g SDS(5％)、0.032g MBA(8％)，加入三口烧瓶中，加入15ml蒸馏水，加入3ml浓度为0.005％的荧光染料溶液，搅拌使其分散均匀。升高温度至40℃，将0.02g过硫酸铵溶于4～5ml蒸馏水中，使用恒压低液漏斗缓慢滴加进三口烧瓶中并引发反应，反应持续4～5小时，反应结束后升温至70℃，除去三氯甲烷，冷却至室温。

剪取8～10cm经过处理的透析袋，加入通过上述步骤得到荧光微球的溶液，两端封口。放入装有蒸馏水的烧杯中进行透析，定时更换蒸馏水，3～4天后取出，装入离心管待用。

对制备得到的荧光微球，我们进行了FT-IR、UV-vis、粒径、以及荧光性能等方面的分析。

1.由图1A可得，图中3436cm^-1有特征峰，是N-H伸缩振动吸收峰，在1666cm^-1为羰基伸缩振动吸收峰，由此说明有酰胺基团存在，证明所合成的荧光纳米微球中包含NIPAM。2968cm^-1处的特征峰是C-H伸缩振动吸收峰，碳氮(C-N)伸缩振动吸收峰出现在1259cm^-1，证明微球中包含DMC。相同的，荧光染料的一些特征吸收峰，在荧光纳米微球的红外图上也有所表现。从图1B中可以看出，单纯的荧光染料的最大吸收出现在430nm左右，而使用两种单体的共聚物包埋形成微球后，最大吸收发生了一定程度的红移，出现在475nm，可见，聚合物的包埋对染料的荧光性能产生了影响。

2.通过改变交联剂、分散剂以及固含量的大小，我们得到了不同粒径分布的荧光微球，具体数据如表1。

表1纳米荧光微球的粒径分布

从表中可以看出，随着分散剂用量的增加，得到的微球的粒径明显变小。当减少交联剂的用量时，微球的粒径也明显的减小。最后结果显示，使用5％SDS，8％MBA以及20ml的去离子水，可以获得100nm左右尺寸较为理想的的荧光微球。

3.我们研究了温度的变化对微球荧光性能的影响。分别测试了微球在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，55℃下的荧光强度。具体实验数据如图2。图2A、2B分别是E1G3、E3G1(E：NIPAM，G：DMC；1、3：质量比)；两种单体配比的纳米荧光微球的荧光强度随温度的变化。图2C是单纯的荧光染料的荧光强度随温度变化图。由图2A、2B可见，温度对微球的荧光性能有影响。温度升高，荧光强度减弱。对比图2C图，温度升高，单纯染料的荧光强度也减弱，但其减弱程度明显低于荧光微球。可见，单纯染料的荧光强度随温度变化不大，而使用聚合物包埋染料后，微球荧光性能具有明显的温敏性。从图2同样可以看出，包埋后，发射波长均为575nm，包埋前后，发射波长基本无偏移。

4.荧光微球的组成成分对微球的荧光性能也有影响，随着NIPAM的用量增加，微球的荧光强度也随着增强。E1G3在25℃时荧光强度只有6.5，而E3G1却达到了79，甚至于高过了单纯的荧光染料在相同温度下的荧光强度。可见，在一定含量范围内，NIPAM的含量对微球的荧光强度有一定的增强作用。同样，荧光染料浓度对荧光微球的荧光强度也有影响，当荧光染料的浓度在一定范围内时，荧光微球的荧光强度随荧光染料浓度的增加而增强。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。