一株鱼腥藻来源的苯丙氨酸脱氨酶的突变体的制作方法

本发明涉及一株鱼腥藻来源的苯丙氨酸脱氨酶的突变体，属于蛋白质工程。

背景技术：

苯丙氨酸脱氨酶(PAL)可用于有效并长期式地治疗苯丙酮尿症(PKU)。因为其的方便有效，用该酶的口服方式越来越受关注。但是，由于肠道里的极端环境，使得该酶的应用受到一定的限制。一株鱼腥藻Anabaena variabilis来源的PAL(Av-PAL)的突变体可以提高该酶在这方面的应用。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种耐酸性能与耐热性能都有改善的苯丙氨酸脱氨酶突变体，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码。

本发明还提供一种重组表达所述苯丙氨酸脱氨酶突变体的方法，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET28a为表达载体，将重组菌种子液接种于含卡那霉素的2YT表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h苯丙氨酸脱氨酶突变体的表达；2YT表达培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)

在本发明的一种实施方式中，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，用His Trap HF柱分离得到苯丙氨酸脱氨酶突变体。

本发明提供的苯丙氨酸脱氨酶突变体E75L的最适pH为7.5，相比野生酶的最适pH下降1，同时具备了更好的pH稳定性；E75L在70℃下的半衰期由野生酶的130min延长至190min；在极端pH 3.5的USP缓冲液中，游离野生酶在30分钟内几乎失活，而游离E75L在3h后保留55％的酶活；在0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，游离野生酶在45min左右失去50％的酶活，游离E75L在3h后保留72％的酶活。因此，本发明提供的苯丙氨酸脱氨酶突变体E75L将更适应口服，能更好的应对肠胃的极端环境。

附图说明

图1野生酶(WT)和E75L的pH-酶活曲线。

图2野生酶(WT)和E75L的pH稳定性曲线。

图3野生酶(WT)和E75L的热稳定性曲线。70℃下保存，适时取样，测定残留酶活。

图4野生酶(WT)和E75L在pH 3.5USP缓冲液中的稳定性。

图5野生酶(WT)和E75L在胰蛋白酶溶液中的稳定性。

具体实施方式

酶活的定义：每分钟每毫克PAL转化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的量(μmols)。

酶活测定方法：在相应100mM缓冲液(pH 6.0-7.0、100mM KH₂CO₃-K₂HCO₃缓冲液；pH 7.0-9.5、100mM Tris-HCl缓冲液)中，以10mM L-苯丙氨酸为底物，在37℃下反应20min，根据290nm的吸收值测定生成的肉桂酸浓度确定酶活。

最适反应pH的确定:分别在不同pH缓冲液中测定野生酶和E75L的酶活，确定最适反应pH。

pH稳定性的确定：将野生酶和E75L在不同pH缓冲液中保留12h后测定残留酶活，得到pH稳定性曲线。

热稳定性确定：将野生酶和E75L保存于70℃金属浴中，适时取样，测定其的残留酶活。

极端条件稳定性测定：将野生酶和E75L保存于pH 3.5的USP(United States Pharmacopeia)缓冲液以及0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，适时取样，测定其的残留酶活。

实施例1

(1)突变体E75L的构建：

以pET28a-PAL为模版，以表1所示引物在表2所示条件下，PCR得到携带编码突变体的基因的重组载体pET28a-PAL/E75L。pET28a-PAL的构建方法参见Moffitt,M.C.,Louie,G.V.,Bowman,M.E.,Pence,J.,Noel,J.P.and Moore,B.S.(2007)Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia lyases:Kinetic and structural characterization.Biochemistry-Us,46,1004-1012.

表1引物

表2全质粒PCR扩增反应体系

PCR扩增反应条件为：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入BL21宿主。

(2)将重组大肠杆菌BL21/pET28a-PAL/E75L接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。

将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mL 2YT表达培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。

(3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HF柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。

(4)最适反应pH的测定：在400μl不同pH的缓冲反应体系中加入3μg纯化后的突变酶E75L，加底物L-苯丙氨酸至10mM，在37℃下反应20min，确定相应酶活。如图1所示，作出pH-酶活曲线，得到最适pH。野生酶最适pH为8.5，E75L最适pH为7.5。不同pH缓冲溶液分别是：pH 6.0-7.0,100mM KH₂CO₃-K₂HCO₃缓冲液；pH 7.0-9.5、100mM Tris-HCl缓冲液。

(5)pH稳定性的确定：将野生酶和E75L在不同pH缓冲溶液中、37℃下保存12h后，在pH 8下测定残留酶活。如图2所示，发现在酸性条件下，E75L的稳定性较野生酶有所提高。

(6)热稳定性的确定：将野生酶(SEQ ID NO.2)和E75L保存于70℃金属浴中，适时取样，测定残留酶活。如图3所示，发现E75L在70℃下的半衰期由野生酶的130min延伸至190min。

(7)测定野生酶和E75L在极端条件稳定性：如图4、5所示，在pH 3.5的USP缓冲液中，游离野生酶在30分钟内几乎失活，游离E75L在3h后保留55％的酶活；在0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，游离野生酶在45min左右失去50％的酶活，游离E75L在3h后保留72％的酶活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株鱼腥藻来源的苯丙氨酸脱氨酶的突变体

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60

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gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420

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gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704

<210> 2

<211> 1704

<212> DNA

<213> 鱼腥藻

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