本发明涉及一种透明质酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
背景技术：
透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。
根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。
水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。
目前，水蛭来源的透明质酸酶的最适pH为5～7，最适反应温度为36℃～38℃。该特性并不适合工业化应用。工业应用过程中，每将反应体系的温度从室温提高一度，都需要消耗更多的能量。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种透明质酸酶突变体，该突变体具有更宽泛的最适反应温度，催化活力也有提高。
所述透明质酸酶突变的氨基酸序列，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基础上，将第121位甘氨酸G突变为亮氨酸L，同时将299位的苏氨酸T突变为异亮氨酸I，同时将321位的丙氨酸突变为脯氨酸P。
本发明还提供一种表达所述透明质酸酶突变体的重组菌，是以枯草芽孢杆菌168为宿主， 以pMA5载体为表达载体，以wapA信号肽引导酶的分泌表达。
在本发明的一种实施方式中，将信号肽wapA通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5，再通过PCR获得编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶突变体基因H，将基因H片段和携带信号肽wapA的pMA5载体均采用EcoRI、BamHI限制性酶切位点双切，然后连接，转化枯草芽孢杆菌168，得到重组菌。
本发明还提供应用所述重组菌发酵生产透明质酸酶突变体的方法，是按10％的接种量将种子培养液转接种于发酵培养基中，发酵培养基的组成为酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氢钠15g/L，硫酸钾4g/L，30℃220rpm培养，发酵培养60h。
本发明将所述透明质酸酶突变体采用食品级安全的工业菌株枯草芽孢杆菌进行表达，获得了透明质酸酶生产菌株。以该重组枯草芽孢杆菌发酵，可在发酵上清液中收集得到透明质酸酶的突变体粗酶液，该酶在pH4～9的范围内保持很好的活性，相比突变前，在耐酸性能上有了提高；在温度25～40℃的条件下能保持很好的活性，相比突变前，在耐受低温的性能上有了显著提高。
具体实施方式
酶活测定方法：反应体系为1ml，用pH 5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/ml的HA，反应体系加入400μl的HA溶液、100μl的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1ml；在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量，1U为一小时内水解产生1μg还原糖所需酶量。
实施例1透明质酸酶突变体的获得
(1)将SEQ ID NO.2所示出发核苷酸序列中编码第121位甘氨酸G、299位的苏氨酸T、321位的丙氨酸A的序列通过分布PCR分别突变为编码亮氨酸L、异亮氨酸I、脯氨酸P的核苷酸序列。
(2)向透明质酸酶突变体N端引入6个组氨酸，设计引物PCR获得编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶突变体基因H。引物序列为：
F：CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGAC
R：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAG
以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pMA5为表达载体，将信号肽wapA(MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPA)通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5。
将基因H片段和携带信号肽wapA的pMA5载体分别采用EcoRI、BamHI限制性酶切位点双切，载体和目的片段分别采用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109 感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确。挑选测序正确的重组克隆菌pMA5-wapA-H。重组质粒电转入表达宿主Bacillus subtilis 168中，重组克隆子经PCR验证正确。以相同策略表达突变前的透明质酸酶，作为对照1，以空载为阴性对照。
(3)验证正确的重组枯草芽孢杆菌菌株pMA5-wapA-H进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的LB培养基，37℃、200rpm培养16h。按10％的接种量转接于25ml的表达无机盐培养基(酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氢钠15g/L，硫酸钾4g/L)，30℃220rpm培养，发酵培养60h，离心收集发酵上清液，作为粗酶液，SDS-PAGE电泳分析发酵上清液的结果表明在58kDa左右出现目标条带，发酵液上清中酶活为1945.5U/ml，未突变的透明质酸酶的活力为15894U/ml，阴性对照未检出透明质酸酶活力。
实施例2透明质酸酶突变体的活性测定
(1)pH对酶活的影响
在加酶之前，以0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调整酶活测定体系的pH为别为2、3、4、5、6、7、8、9，分别测定透明质酸酶突变体、未突变的透明质酸酶的活力。以两酶各自在pH 5.5的酶活反应体系为基础，计算各自的残余酶活。
表1
(2)温度对酶活的影响
将透明质酸酶突变体、未突变的透明质酸酶的粗酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，保温30min，然后用于测定酶活。以两酶各自在38℃的酶活为基础，计算各自的残余酶活。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 吴银娣
<120> 一种透明质酸酶突变体及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> 水蛭
<400> 1
Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser
20 25 30
Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe
35 40 45
Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr
50 55 60
Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys
65 70 75 80
Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr
85 90 95
Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe
100 105 110
Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe
115 120 125
Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met
130 135 140
Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys
145 150 155 160
Val Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu
165 170 175
Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu
180 185 190
Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn
195 200 205
Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr
210 215 220
Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr
225 230 235 240
Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr
245 250 255
Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val
260 265 270
Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu
275 280 285
Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp
290 295 300
Arg Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr
325 330 335
Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp
340 345 350
Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val
355 360 365
Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr
370 375 380
Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu
385 390 395 400
Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile
405 410 415
Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu
420 425 430
Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu
435 440 445
Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys
450 455 460
Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser
465 470 475 480
Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
485
<210> 2
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<212> DNA
<213> 水蛭
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atgaaagaga tcgcggtgac aattgacgat aagaacgtta ttgcctctgt cagcgagtca 60
ttccatggtg ttgcctttga tgcgtcgtta ttttcaccga aggggttgtg gagctttgtt 120
gacattacct caccgaaatt gtttaaactc ttggagggtc tctctcctgg ttacttcagg 180
gttggaggaa cgtttgctaa ctggctgttc tttgacttag atgaaaataa taagtggaaa 240
gactattggg cttttaaaga taaaacaccc gagactgcaa caatcacaag gaggtggctg 300
tttcgaaaac aaaacaacct gaaaaaagag acttttgacg acttagtcaa actaaccaaa 360
ggaagcaaaa tgagactgtt atttgattta aacgctgaag tgagaactgg ttatgaaatt 420
ggaaagaaaa tgacatccac ttgggatagc tcggaagctg aaaaattatt caaatactgt 480
gtgtcaaaag gttatggaga taatattgat tgggaacttg gtaatgaacc ggaccatacc 540
tccgcacaca atcttactga aaagcaagtt ggagaggact ttaaagccct gcataaagtg 600
ctagagaaat atccgacgtt gaataaagga tcgcttgttg gacctgacgt tggatggatg 660
ggagtctctt atgtgaaagg attagcagac ggggctggtg atcacgtaac cgcttttact 720
cttcatcagt attattttga cggcaatacc tcagatgtgt caacatacct tgacgctact 780
tattttaaaa aacttcaaca gctgtttgac aaagttaagg atgtcttgaa aaattctcca 840
cataaagata aaccgctctg gcttggagaa acaagttctg gatacaacag cggcacaaaa 900
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gcgaacaatg tgaaagttgt gataagacaa acgatctata atggatacta cggacttctt 1020
gataaaaata ctctagagcc aaatccggat tattggctaa tgcatgttca caattctctg 1080
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gcacagtgca ccaaaacaaa tagcaaacat actcagagta gatactacaa gggctcattg 1200
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<212> PRT
<213> wapA
<400> 5
Met Lys Lys Arg Lys Arg Arg Asn Phe Lys Arg Phe Ile Ala Ala Phe
1 5 10 15
Leu Val Leu Ala Leu Met Ile Ser Leu Val Pro Ala
20 25