技术领域
本发明及猕猴桃种植技术领域，特别涉及一种猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测方法。
背景技术：
猕猴桃是猕猴桃科（Actinidiacea）猕猴桃属（Actinidia）落叶藤本果树，其果实营养丰富，富含氨基酸、蛋白质、矿物质以及多种维生素，尤其是维生素C含量居各种水果之首。同时，猕猴桃又具有很高药用价值，猕猴桃全株均可入药，其根、果实等部位提取物具有抗突变、抗肿瘤、抗氧化等作用。猕猴桃在我国分布范围很广，北方的陕西、甘肃和河南，南方的两广和福建，西南的贵州、云南、四川、重庆，以及长江中下游流域的各省(区)都有栽培种植。
近年来，由于猕猴桃种植面积迅速扩大，猕猴桃细菌性溃疡病（kiwifruit bacterial canker）快速蔓延，在日本、美国、韩国、中国、意大利、法国、葡萄牙、西班牙、新西兰、瑞士和智利等国家相继被发现，并在报道的国家造成了严重的产量和经济损失。目前该病害已成为2005年以来猕猴桃栽培过程中最具毁灭性的危害，严重威胁世界猕猴桃的安全生产。
据有关报道，猕猴桃细菌性溃疡病菌在潜伏期很难发现，具有一定的隐蔽性，且病原菌极易随繁殖材料和苗木远距离传播。虽然化学和生物农药在防治方面有一定的效果，但是一旦在果园发生，要彻底防治就相当难。猕猴桃细菌性溃疡病是一种毁灭性病害，由丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidae）引起，主要为害猕猴桃的主干、枝干和叶片。到目前为止，有关猕猴桃细菌性溃疡病病菌鉴定的研究很多，但大多集中于病原菌的形态学和生理生化特性等传统的鉴定方法。前期对病原菌的检测主要通过症状、形态、生理生化反应等方法开展，这些方法费时费力，需要对病原进行分离纯化，往往因为样品带菌少和分离纯化过程复杂等而失败，从而造成漏检及疫情的逃逸、扩散。
传统的检测方法如分离培养、生理生化指标的测定、寄主症状观察等都比较耗时费力，而且经验性强，不能满足口岸检疫快速验放的要求，更难以标准化和大规模推广应用。随着生命科学和基础科学的迅猛发展，血清学、分子杂交及聚合酶链式反应（PCR）等方法、技术逐步应用到植物病原细菌的检测和鉴定工作中，这些方法特异性好，灵敏度高，耗时短，能够很好地提高检测效率。但是这些方法易出现假阳性或假阴性结果，容易对实验室造成污染，也容易对实验人员的身体造成伤害。
技术实现要素：
本发明为解决上述技术问题为提供一种自动化程度高、检测快速、灵敏度高的猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、将细菌ITS通用引物对猕猴桃溃疡病菌标准菌株和其它猕猴桃溃疡病病原菌的16S~23SrDNA间的ITS区域进行PCR扩增并测序，并得到测序后的序列；
步骤二、用生物学软件clastal X对测序后的序列及GenBank数据库中已登录的丁香假单胞杆菌属ITS序列进行多重同源性比较分析，并找出猕猴桃溃疡病菌稳定性点突变区；
步骤三、根据猕猴桃溃疡病菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计软件Prmier Express设计猕猴桃溃疡病菌特异引物和猕猴桃溃疡病菌特异探针；
步骤四、对猕猴桃溃疡病菌特异引物和猕猴桃溃疡病菌特异探针进行可用性检测、特异性检测、以菌液为模板的灵敏度检测、以DNA为模板的灵敏度检测、以接种猕猴桃溃疡病菌的猕猴桃枝条为对象的荧光PCR检测和以田间发病样品为对象的荧光PCR检测；
步骤五、重复步骤三和步骤四直至获得用于对猕猴桃细菌性溃疡病菌检测的实时荧光PCR引物和实时荧光PCR探针。
本实发明有益效果是：通过建立基于实时荧光PCR的快速猕猴桃溃疡病菌分子检测技术，可以有效地防止检测过程中的污染和假阳性结果。并且可对猕猴桃种苗、接穗、花、果实上的猕猴桃溃疡病菌进行微量检测，以及带有潜伏病菌而未表现症状的猕猴桃材料进行有效的监测，阻止该病害在新区的扩散蔓延。依据猕猴桃溃疡病菌ITS序列的多态性得到实时荧光PCR引物和探针，建立猕猴桃溃疡病菌实时定量荧光PCR检测体系，实现猕猴桃溃疡病菌的快速、特异、灵敏、定量检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中可用性检测为以猕猴桃溃疡病菌标准菌株的染色体DNA为模板进行实时定量荧光PCR的检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中特异性检测为选取猕猴桃溃疡病菌不同菌株及其近似亚种、近似种、近似属的菌株进行荧光PCR反应的检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中以菌液为模板的灵敏度检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌标准菌株作为阳性，在NB液体培养基中26℃振荡培养12h；
将培养好的菌液进行10×浓度梯度稀释，通过平板计数法计算菌液原始浓度；
以连续稀释的不同浓度梯度菌液为模板进行荧光PCR检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中以DNA为模板的灵敏度检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌标准菌株作为阳性，在NA液体培养基中26℃振荡培养12h；
提取培养好的猕猴桃溃疡病菌菌液的总DNA，通过ND-2000超微量分光光度计测定DNA的浓度，将培养好的菌液进行10×浓度梯度稀释；
以DNA各浓度梯度为模板进行荧光PCR检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中以接种猕猴桃溃疡病菌的猕猴桃枝条为对象的荧光PCR检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌在NA液体培养基中26℃振荡培养12h；
通过注射器针刺将培养好的猕猴桃溃疡病菌菌液接种至健康猕猴桃植株的茎杆上；
通过蘸有无菌水的棉花对接种后的猕猴桃植株进行保湿，观察猕猴桃发病情况；
在接种猕猴桃植株发病后，提取发病植株有症状部位及无症状部位的总DNA；
以猕猴桃溃疡病菌标准菌株为阳性对照，进行荧光PCR检测。
作为本发明的一种优选结构，所述步骤四中以田间发病样品为对象的荧光PCR检测步骤为：
采集田间发病猕猴桃样品，提取其病健交界处的总DNA；
以猕猴桃溃疡病菌标准菌株作阳性对照，健康的猕猴桃样品作阴性对照，进行实时荧光PCR检测。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明一种猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、将细菌ITS通用引物对猕猴桃溃疡病菌标准菌株和其它猕猴桃溃疡病病原菌的16S~23SrDNA间的ITS区域进行PCR扩增并测序，并得到测序后的序列；
步骤二、用生物学软件clastal X对测序后的序列及GenBank数据库中已登录的丁香假单胞杆菌属ITS序列进行多重同源性比较分析，并找出猕猴桃溃疡病菌稳定性点突变区；
步骤三、根据猕猴桃溃疡病菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计软件Prmier Express设计猕猴桃溃疡病菌特异引物和猕猴桃溃疡病菌特异探针；
步骤四、对猕猴桃溃疡病菌特异引物和猕猴桃溃疡病菌特异探针进行可用性检测、特异性检测、以菌液为模板的灵敏度检测、以DNA为模板的灵敏度检测、以接种猕猴桃溃疡病菌的猕猴桃枝条为对象的荧光PCR检测和以田间发病样品为对象的荧光PCR检测；
步骤五、重复步骤三和步骤四直至获得用于对猕猴桃细菌性溃疡病菌检测的实时荧光PCR引物和实时荧光PCR探针。以获得对猕猴桃溃疡病菌检测灵敏度高、特异性强的实时荧光PCR引物和探针为准。
通过本实施例，可建立基于TaqMan实时荧光PCR的快速猕猴桃溃疡病菌分子检测技术，可以有效地防止检测过程中的污染和假阳性结果。并且可对猕猴桃种苗、接穗、花、果实上的猕猴桃溃疡病菌进行微量检测，以及带有潜伏病菌而未表现症状的猕猴桃材料进行有效的监测，阻止该病害在新区的扩散蔓延。
本实施例中所述步骤四中可用性检测为以猕猴桃溃疡病菌标准菌株的染色体DNA为模板进行实时定量荧光PCR的检测。
本实施例中所述步骤四中特异性检测为选取猕猴桃溃疡病菌不同菌株及其近似亚种、近似种、近似属的菌株进行荧光PCR反应的检测。
本实施例中所述步骤四中以菌液为模板的灵敏度检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌标准菌株作为阳性，在NB液体培养基中26℃振荡培养12h；
将培养好的菌液进行10×浓度梯度稀释，通过平板计数法计算菌液原始浓度；
以连续稀释的不同浓度梯度菌液为模板进行荧光PCR检测。
本实施例中所述步骤四中以DNA为模板的灵敏度检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌标准菌株作为阳性，在NA液体培养基中26℃振荡培养12h；
提取培养好的猕猴桃溃疡病菌菌液的总DNA，通过ND-2000超微量分光光度计测定DNA的浓度，将培养好的菌液进行10×浓度梯度稀释；
以DNA各浓度梯度为模板进行荧光PCR检测。
本实施例中所述步骤四中以接种猕猴桃溃疡病菌的猕猴桃枝条为对象的荧光PCR检测步骤为：
将猕猴桃溃疡病菌在NA液体培养基中26℃振荡培养12h；
通过注射器针刺将培养好的猕猴桃溃疡病菌菌液接种至健康猕猴桃植株的茎杆上；
通过蘸有无菌水的棉花对接种后的猕猴桃植株进行保湿，观察猕猴桃发病情况；
在接种猕猴桃植株发病后，提取发病植株有症状部位及无症状部位的总DNA；
以猕猴桃溃疡病菌标准菌株为阳性对照，进行荧光PCR检测。
本实施例中所述步骤四中以田间发病样品为对象的荧光PCR检测步骤为：
采集田间发病猕猴桃样品，提取其病健交界处的总DNA；
以猕猴桃溃疡病菌标准菌株作阳性对照，健康的猕猴桃样品作阴性对照，进行实时荧光PCR检测。
本发明依据猕猴桃溃疡病菌ITS序列的多态性设计TaqMan实时荧光PCR引物和探针，同时建立猕猴桃溃疡病菌实时定量荧光PCR检测体系，实现猕猴桃溃疡病菌的快速、特异、灵敏、定量检测。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。