一种光合细菌发酵液的制备方法及对早疫病的应用与流程

本发明是一种光合细菌发酵液的制备方法及对早疫病的应用，涉及生物农药技术领域，具体是一种沼泽红假单胞菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用。

背景技术：

番茄是一种重要的蔬菜作物，其适应范围广，广泛分布于世界各地，被列为全世界产量最高的30种农作物之一。在番茄生产中，由于病虫危害，经常造成大面积减产。其中，番茄早疫病是番茄生产上的主要病害之一，是一种世界性病害，由茄链格孢属真菌Alternaria solani(Ellis et Martin)引起，该菌寄主范围广泛，除番茄外，还可感染辣椒、茄子、曼陀罗和马铃薯等。在美国、澳大利亚、以色列、印度、希腊等地发病率都很高。20世纪80年代以来在我国大部分地区也普遍发生，特别是保扩地番茄种植面积越来越大，早疫病的为害范围和程度也在逐年增加，造成常年损失20％～30％，严重时可达50％以上甚至毁棚，而且因果实内含有毒素，会使人体患有血液病，影响人体健康。

目前番茄生产上并无高抗或免疫的品种，运用抗病种质防治该病并不现实，因此早疫病多采用化学药剂防治，随着农药使用量的增加，农药残留、农药抗性、环境污染、非靶标生物受害和慢性毒性等诸多问题日益显露出来，同时残留的农药通过食物链进入人体内逐渐积累，易诱发癌症等多种疑难病症。我国加入WTO和对环境保护日益重视的形势下，我们必须重视绿色食品的生产，以适应国内外形势发展的需要。

因此，为了实现番茄的高产、无毒、无公害可持续发展等目标，有针对性的发展高效、低毒、无残留绿色生物农药来防治番茄病害，尤其是番茄早疫病的发生，最大限度的降低由于病害爆发引起的减产、化学农药过量施用严重影响番茄品质的现状，开发生物农药成为一个行之有效的解决途径。

目前，用于番茄早疫病生物防治的拮抗微生物主要包括芽孢杆菌、假单孢菌、放线菌、链霉菌、木霉菌、海洋放线菌等。它们对番茄早疫病菌产生抑制作用的机理主要是通过竞争性生长繁殖而占居生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长与增殖，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使早疫病菌得不到生存空间，保护了番茄免受病原菌为害。近年来，国内外学者在光合细菌的基础性研究、应用研究方面也取得很大的进展。诸多研究结果证明，光合细菌的一些活性物质能钝化病原体的致病力、促进放线菌等有益微生物增殖，以及抑制病原体的生长，从而有效地抑制某些植物病害的发生与蔓延。因而，利用光合细菌防治番茄早疫病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种光合细菌发酵液的制备方法及对早疫病的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种光合细菌发酵液的制备方法，包括：

选取光合细菌菌株；

对光合细菌菌株进行活化；

种子培养；

生产培养。

进一步地，所述选取光合细菌菌株的具体步骤为：选取沼泽红假单胞菌作为光合细菌菌株。

进一步地，所述对光合细菌菌株进行活化的具体步骤为：将沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现。

进一步地，所述种子培养的具体步骤为：将培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液。

进一步地，种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。

进一步地，所述生产培养的具体步骤为：将种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，对沼泽红假单胞菌生防菌剂离心收集上清液，制得光合细菌生防发酵液。

进一步地，生产培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。

进一步地，离心时转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。

一种光合细菌发酵液对早疫病的应用，光合细菌生防发酵液应用于拮抗链格孢菌或防控番茄早疫病。

本发明的有益效果：(1)本发明的沼泽红假单胞菌的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到番茄早疫病防控的生防菌剂及生防发酵液。

(2)本发明的沼泽红假单胞菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

附图说明

图1为本发明的光合细菌培养基对照图；

图2为本发明的光合细菌发酵液图；

图3为本发明的1000倍嘧菌酯处理图；

图4为本发明的生防发酵液处理的菌丝对离体果实致病影响效果图；

图5为本发明的对照处理的菌丝对离体果实致病影响效果图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

本发明提供一种技术方案：一种光合细菌发酵液的制备方法，包括：

选取光合细菌菌株；

对光合细菌菌株进行活化；

种子培养；

生产培养。

选取光合细菌菌株的具体步骤为：选取沼泽红假单胞菌作为光合细菌菌株。

对光合细菌菌株进行活化的具体步骤为：将沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现。

种子培养的具体步骤为：将培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液。

种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。

生产培养的具体步骤为：将种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，对沼泽红假单胞菌生防菌剂离心收集上清液，制得光合细菌生防发酵液。

生产培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。

离心时转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。

一种光合细菌发酵液对早疫病的应用，光合细菌生防发酵液应用于拮抗链格孢菌或防控番茄早疫病。

作为本发明的一个实施例：本发明的沼泽红假单胞菌的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到番茄早疫病防控的生防菌剂及生防发酵液。

本发明的沼泽红假单胞菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

作为本发明的一个实施例：光合细菌菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H₂S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～32℃，pH＝7。

作为本发明的一个实施例：一种光合细菌生防菌剂，采用实施例1的沼泽红假单胞菌菌株为原料，通过经活化、种子培养、生产培养制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：

(1)活化：将沼泽红假单胞菌I-1-1菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)₂SO4 1.8g/L、NaCO₃1.0g/L、YE 1.5g/L、K₂HPO4 0.4g/L、MgSO₄0.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0。

(2)种子培养：将步骤(1)培养出的红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为((NH4)₂SO4 1.8g/L、NaCO₃1.0g/L、YE 1.5g/L、K₂HPO4 0.4g/L、MgSO₄ 0.5g/L，pH＝7.0。

(3)生产培养：将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基(培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致)进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期即制得生防菌剂。

作为本发明的一个实施例：一种光合细菌生防发酵液，采用实施例1的沼泽红假单胞菌菌株为原料，通过经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：取实施例2中获得的生防菌剂，经发酵培养6d，发酵培养在温度为30-35℃、光照条件为3000Lx-4000Lx条件下进行，发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同，然后在6000rpm条件下离心5min-8min，离心收集上清液，将上清液用细菌过滤器过滤，得到无沼泽红假单胞菌菌体的上清液即为生防发酵液，4℃保存备用。

作为本发明的一个实施例：一种实施例3的生防发酵液在拮抗茄链格孢菌中的应用，具体的应用方法为：

番茄早疫菌丝平板测定试验：以茄链格孢菌为靶标，采用平板法做抑菌试验。将光合细菌生防发酵液与45℃-50℃熔融态的5×PDA培养基(土豆200g榨汁，葡萄糖4g，琼脂4g，加水至200mL)按1:1混合，并以光合细菌培养基及嘧菌酯为对照，接入培养5d的番茄早疫病病菌，28℃培养，重复5次，28℃培养3d后计算蛋白液对炭疽病菌的抑制率。

抑制率＝(菌落直径_对照菌落-菌落直径_蛋白处理)/菌落直径_对照菌落×100％。

参见图1、图2、图3，图1、图2、图3分别为光合细菌培养基对照、光合细菌发酵液和1000倍嘧菌酯处理，从图1中可以知道：光合细菌发酵液处理对茄链格孢菌后，菌丝黑色素消失，菌丝生长速度比对照快，且菌丝稀疏。

作为本发明的一个实施例：一种实施例4中生防发酵液在番茄早疫病病防治中的应用，具体的应用方法为：

采集成熟番茄，经表面消毒后，用HAMILTON微量注射器的针头在果面上刺2个接种点，将生防发酵液处理和对照处理的菌丝分别接种于番茄接种点上，每点接1饼(直径6mm)，置于12h光照/d、RH≥95％的条件的培养箱中培养，第7d调查发病情况。病斑直径≥6mm的视为发病，统计发病率，即病斑数占总接种点的百分率。设4次重复，每重复至少5个果。

参见图4和图5，图4和图5分别为生防发酵液处理的菌丝和对照处理的菌丝对离体果实致病影响效果，从图4和图5中可以发现：对照处理的茄链格孢菌致使番茄的发病率为100％，而发酵液处理后番茄并未发病。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。