本发明属于药物技术领域，具体涉及氮杂环类化合物及其应用，尤其是具有NS3丝氨酸蛋白酶抑制活性的氮杂环类化合物及其制备预防和/或治疗病毒感染疾病的药物中的应用。
背景技术：
据统计，全球大约有1.3-1.7亿人感染丙型肝炎病毒，大约是感染艾滋病毒人数的2倍。丙型肝炎病毒(HCV)感染可致严重的如肝硬化、肝癌等晚期肝病，严重威胁人类健康。目前，丙型肝炎病毒感染率较高的地区为在非洲及中东地区。
HCV隶属于黄病毒(Flaviviridea)科，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。HCV的基因组长9500-10000bp，在5'非编码区的下游紧接一开放的阅读框(open reading frame，ORF)，其基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码约3010-3033个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白。其中，结构蛋白参与病毒的组装，而非结构蛋白包括NS2，NS3,NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对比病毒的生活周期非常重要，是病毒基因复制、表达的核心催化区域。NS3蛋白还具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制；NS4的功能尚不清楚；NS5A是一种磷酸蛋白，可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，对于病毒的复制起重要作用；而NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，参与HCV基因组复制。NS2/NS3形成的连接由NS3的N末端180个氨基酸与NS2的含Zn2+的金属蛋白酶催化裂解；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B形成的连接由位于NS3的N末端的丝氨酸蛋白酶催化裂解。
NS3丝氨酸蛋白酶是HCV复制周期中的重要蛋白。研究表明，抑制NS3丝氨酸蛋白酶活性可以有效地抑制病毒的增殖与复制，因此，NS3丝氨酸蛋白酶成为了抗丙型肝炎病毒药物研发的热点。为了更好的满足市场需求，本发明提供了一类新型的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种氮杂环类化合物，以开发成为一种新型的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，应用于因丙型肝炎病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒等病毒感染引起的相关疾病治疗的领域中。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种式(Ⅰ)所示的化合物：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、药学上可接受的盐、前药、活性代谢物及代谢物的药学上可接受的盐及其混合物形式；
其中，为各自独立的单键或双键；
R1和R2独立地选自芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；
R3选自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4选自氢原子、卤素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、杂芳基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基；
n为0或1；
R5为芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基。
优选的，所述的化合物其具有如式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示结构：
其中，R1和R2独立地选自芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；
R3选自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4选自氢原子、卤素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、杂芳基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基；
R5为芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基。
优选的，所述芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基、或杂环烷基中的一个或多个氢原子各自独立被卤素、硝基、氰基、氧代、氧代、烷基、杂烷基、环烷基、链烯基、链炔基、卤代烯基、卤代炔基、卤代烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、环烷基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基杂烷基、杂环烷基杂烷基、芳基杂烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷氧芳基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、杂环烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、磺酰基、氨基、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-COR6、-NHS(O)mR6、-NHC(O)R6、-NHC(O)OR6、-NR7R8、-OC(O)NR7R8、-OC(O)R7R8、-SH、-SR7所取代；
R6选自任选取代芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基；
R7和R8各自独立地选自氢原子，任选取代芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基；
m为0、1或2。
优选的，R1为1-2个氢原子被包含羟基、卤素中的一种或多种基团所取代的芳基；
R2为0-1个氢原子被包含卤素、烷基中的一种基团所取代的芳基或杂芳基；
R3为R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5和-S(O)2-R5中的一种；
R4为0-1个氢原子被包含卤素、烷基中的一种基团所取代的氨基、烷基或芳基；
R5为0-1个氢原子被包含羟基、硝基、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、芳基和-NR6R7中的一种基团所取代的芳基或杂芳基；
R6、R7为氢原子或烷基；R6和R7为独立取代或连接成环。
进一步优选的，R1选自
优选的，R2选自
优选的，R3选自
优选的，R4为
或-NH2。
优选的所述的化合物具有以下其中之一的结构：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、药学上可接受的盐、前药、活性代谢物及代谢物的药学上可接受的盐及其混合物。
本发明还提供了一种药物组合物，包含上述的化合物。
进一步优选的，所述药物组合物还包括抑制病毒增殖与复制的药物和/或药学上可接受的辅料。
本发明还提供了所述化合物或所述的药物组合物在制备预防和/或治疗病毒感染疾病中的应用。
优选的，所述病毒为黄病毒属相关病毒。
进一步，优选的，所述病毒为丙型肝炎病毒、登革热病毒和/或西尼罗河病毒。
上述氮杂环类化合物的各种异构体包括但不限于内消旋体、外消旋体、立体异构体、顺反异构体和/或互变异构体。
本发明提供的氮杂环类化合物是一类新型的具有NS3丝氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，制备过程操作简单安全；经过抗病毒活性实验测定，表明该类化合物具有良好的NS3丝氨酸蛋白酶抑制活性，具有开发成为一种新型的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的潜力，可应用于预防和治疗因丙型肝炎病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒等黄病毒属病毒感染引起的相关疾病。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
本发明所使用的术语“任选取代的”与“取代或非取代的”这个术语可以交换使用。一般而言，术语“任选地”不论是否位于术语“取代的”之前，表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，羟基，氨基，卤素，氰基，芳基，杂芳基，烷氧基，烷基，烯基，炔基，杂环基，巯基，硝基，芳氧基等等。
本发明使用的术语“烷基”或“烷基基团”，表示含1-20个碳原子的饱和直链或支链一价碳氢化合物原子团。其中所述烷基基团可以独立任选地被一个或多个取代基所取代。除非另外详细说明，烷基基团含有1-20个碳原子，其中一些实施例是，烷基基团含有1-10个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-8个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-6个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-4个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-3个碳原子。
烷基基团的实例包含，但并不限于，甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)，异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)，正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)，异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)，仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)，叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)，正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)，正庚基，正辛基，等等。
本发明所使用的术语“烷基”和其前缀“烷”，都包含直链和支链的饱和碳链。
本发明涉及的氮杂环类化合物，其药学上可接受的盐，及其药物制剂，对NS3丝氨酸蛋白酶，尤其是NS3丝氨酸蛋白酶调节的疾病或病症的治疗有潜在的用途。特别是，本发明涉及一种如式(I)所示的化合物：
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、药学上可接受的盐、前药、活性代谢物及代谢物的药学上可接受的盐及其混合物形式。
在一些实施方案，R1选自
在一些实施方案，R2选自
在一些实施方案，R3选自
在一些实施方案，R4为
或-NH2。
在另外一些实施方案，本发明涉及到以下其中之一的化合物或其立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或它的前药，但绝不限于这些化合物：
本发明的药物组合物的包括式((I)的化合物，优选为实施例1-4的化合物，尤其是本发明所列出的化合物。
像本发明所描述的，本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。这些像本发明所应用的，包括任何溶剂，稀释剂，或其他液体赋形剂，分散剂或悬浮剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂，乳化剂，防腐剂，固体粘合剂或润滑剂，等等。
本发明的药物组合物进一步包含抑制病毒增殖与复制的药物。所述抑制病毒增殖与复制的药物可以与本发明的化合物分开给药，作为多给药方案的一部分。或者是单剂型的一部分，与本发明的化合物混合在一起形成单个组合物。
本发明的组合物可以是口服给药，注射给药，喷雾吸入法，局部给药，经直肠给药，经鼻给药，含服给药，阴道给药或通过植入性药盒给药。
其中口服给药可以是以任何可接受的口服剂型进行口服给药，包括但并不限于，胶囊，片剂，水制悬浮液或溶液。
本发明的化合物将应用于病毒感染疾病预防和/或治疗，进一步包括但并不限于，丙型肝炎病毒、登革热病毒和/或西尼罗河病毒的病毒感染疾病。
在下列实施例中，除非另有指明外，所有温度单位为摄氏度。使用的各种起始原料和试剂均来自市售，除非另有指明，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用；玻璃器皿用烘箱干燥和/或加热干燥。薄层层析用硅胶板规格为0.15-0.2mm，柱层析用硅胶的规格为200-300目；质谱是用MS仪测定得到，离子化方式可为ESI或APCI。
一般地，本发明的化合物可以通过本发明所描述的方法制备得到，除非有进一步的说明，其中取代基的定义如式(I)所示。下面的反应方案和实施例用于进一步举例说明本发明的内容。下面的部分实施例仅仅是用来说明具体化合物的合成方法。但在合成方法上并没有任何限制。在实施例中未列出的化合物，也可以用与下面同样的合成路线与合成方法，选择适当的起始原料，在有必要的地方稍加适当的常识性的反应条件调整即可制备。
实施例1
合成路线：
第一步：中间体1c的合成
往250mL的圆底烧瓶中加入化合物1a(6g，0.0441mol)、化合物1b(4.85g，0.0441mol)、30％(mg/vol)氢氧化钠乙醇溶液100mL，室温搅拌反应8h；反应完毕后，将反应液倒入冰水中，用盐酸调节反应液的pH至2-3，过滤，收集固体；将固体溶于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，然后加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液减压浓缩，再用乙醇进行重结晶，得到7.6g化合物1c。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ12.7(1H,s),8.02(1H,d),7.72(1H,d),7.34(1H,m),7.25(1H,m),7.13(1H,m),7.02(1H,dd),7.31(1H,t),6.92(1H,m),6.74(1H,t)。
第二步：中间体1d的合成
往250mL的圆底烧瓶中加入化合物1c(7.5g，0.035mol)、乙醇溶液50mL、水合肼(2.19g，0.035mol)，80℃搅拌反应3h；反应完毕后，将反应液置于4℃冰箱过夜；过滤，加入200mL乙醇/正己烷(3:1)重结晶，得到5.9g化合物1d。
第三步：产物NI-H-00023的合成
往50mL的圆底烧瓶中加入化合物1d(200mg，0.877mol)、四氢呋喃5mL、化合物1f(182mg，0.877mol)和DIEA(169mg，1.31mmol)，室温下反应2h；反应完毕后，于反应液中加入30mL水和30mL乙酸乙酯，混匀，静置分层，分离有机层，收集水层并加入乙酸乙酯萃取(2次，每次30mL)，合并有机层，浓缩蒸馏；再用制备薄层板进行刮板，得到化合物1。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ9.85(s,1H),7.90(d,2H),7.72(d,2H),7.41–7.21(m,2H),7.05–6.86(m,3H),6.61-6.60(dd,1H),6.02-5.98(dd,1H),3.89-3.81(m,1H),3.56-3.50(m,1H),2.43(s,3H).
实施例2
按照实施例1所述方法合成下述吡唑类化合物，如表1所示。
表1合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的吡唑类化合物
实施例3
合成路线：
第一步：中间体2c的合成
往250mL的圆底烧瓶中加入化合物2a(3g，0.0195mol)、化合物2b(2.42g，0.0195mol)、30％(mg/vol)氢氧化钠乙醇溶液50mL，室温搅拌反应8h；反应完毕后，将反应液倒入冰水中，用盐酸调节反应液的pH至2-3，过滤，收集固体；将固体复溶于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，然后加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液减压浓缩，再用乙醇进行重结晶，得到4.3g化合物2c。
第二步：产物NI-H-00207的合成
往100mL的圆底烧瓶中加入盐酸苯甲脒(60mg，0.385mmol)、碳酸钾(112mg，0.809mmol)和乙醇溶液30mL；于上述反应液中缓慢滴加化合物2c(200mg，0.769mmol)的乙醇溶液15mL，90℃反应过夜；待反应液温度降到室温后，过滤，收集固体，再用水和乙醇洗涤，即得103mg化合物2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.56(s,1H),8.28-8.25(m,2H),8.05(s,1H),7.94(d,2H),7.75-7.71(m,2H),7.35(d,2H),7.51-7.48(m,1H),7.37(s,1H)7.08-7.06(m,1H),6.96(m,1H)。
实施例4
按照实施例3所述方法合成下述嘧啶类化合物，如表2所示。
表2合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的嘧啶类化合物
实施例5 NS3丝氨酸蛋白酶抑制活性实验
1、配制反应缓冲液，反应缓冲液成分为：HEPES 50mM,NaCl 150mM,甘油15％,Triton X-100 0.15％,DTT 10mM,PEG8000 0.1％,pH 7.5。
2、用DMSO将受试化合物稀释成10μM或100μM。
3、然后在96孔板中加入NS3丝氨酸蛋白酶、缓冲液和上述配置好的受试化合物，使反应终体积为100uL。混匀，室温预孵30min；设2组反应体系，每组设三次重复，并设空白对照。
4、在上述反应体系中分别加入HCV NS3/NS4特异性荧光多肽底物或WNV(西尼罗河病毒)NS3/NS4特异性荧光多肽底物使其终浓度为100nM，混匀后在室温下孵育1h，再加入100μL 500mM的吗啉乙磺酸终止反应。
5、采用酶标仪检测反应体系中的荧光信号，激发波长设为340nm，发射波长设为615nm，记录实验结果。
表3部分受试化合物对NS3丝氨酸蛋白酶的抑制活性
注：受试化合物对NS3丝氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示
如表3结果显示，当受试化合物的浓度设为10μM时，除了编号为NI-H-00035的化合物，表格中所示化合物对HCV的NS3丝氨酸蛋白酶的抑制率为7％～29％，对WNV的NS3丝氨酸蛋白酶的抑制率为8％～19％；当受试化合物的浓度设为100μM时，表格中所示化合物对HCV的NS3丝氨酸蛋白酶具有较强的抑制活性，抑制率为58％～73％，对HCV的NS3丝氨酸蛋白酶的抑制率为28％～59％。
表1以及表2中其他化合物在浓度为100μM时，对HCV以及WNV NS3蛋白酶的抑制率均低于20％。
实施例6抗病毒活性实验
1、抗丙型肝炎病毒(HCV)活性实验
(1)将含有HCV genotype 2(JFH1)的亚基因组RNA复制子的细胞株Huh7.5.1接种于96孔板中，每孔细胞数量为2×104个，置于CO2培养箱中培养24h后，加入采用DMSO梯度稀释后的受试化合物，置于CO2培养箱中孵育48h后，测定化合物的EC50值。表4为部分化合物的EC50值。EC50为半最大效应浓度。
(2)将含有HCV genotype 1的亚基因组RNA复制子BM4-5细胞系细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为2×104个，置于CO2培养箱中培养24h后，加入采用DMSO梯度稀释后的受试化合物，置于CO2培养箱中孵育48h后，测定化合物的EC50值。表4为部分化合物的EC50值。
2、抗登革热病毒(DENV)活性实验
将BHK-21细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为5×104个，置于CO2培养箱中培养24h后，加入含有海肾荧光素酶(Rluc)报告基因的DENV基因转染BHK-21细胞，加入采用DMSO梯度稀释后的受试化合物，置于CO2培养箱中孵育48h后，测定化合物的EC50。表4为部分化合物的EC50。
3、抗西尼罗河病毒(WNV)活性实验
将Vero细胞系细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为8×104个，置于CO2培养箱中培养6h后，加入含有海肾荧光素酶(Rluc)报告基因的复制子全长WNV基因转染Vero细胞，加入采用DMSO梯度稀释后的受试化合物，置于CO2培养箱中孵育24h后，测定化合物的EC50。表4为部分化合物的EC50。
4、受试化合物对病毒孵育细胞的毒性实验
将细胞株Huh 7.5.1、BM4-5细胞系细胞、BHK-21细胞和Vero细胞系细胞分别接种于96孔板中，每孔细胞数量依次设为2×104个、2×104个、5×104个和8×104个，置于CO2培养箱中培养6h后，将96孔板内的细胞培养基吸去，加入用培养基梯度稀释后的受试化合物，将细胞放回培养箱，继续培养48h后进行MTT细胞活性测试，测定化合物的CC50值。CC50为50％的细胞发生病变时的药物浓度，部分化合物的CC50值见表4。
表4受试化合物在不同细胞系中的活性数据
注：n/d为尚未检测；
如表4结果显示，受试化合物NI-H-00023、NI-H-00035、NI-H-00246对丙肝病毒具有一定的抑制活性；而化合物NI-H-00003、NI-H-00005、NI-H-00247对登革热病毒和西尼罗河具有一定的抑制活性；NI-H-00001、NI-H-00002、NI-H-000018、NI-H-00246对丙肝病毒、登革热病毒及西尼罗河病毒均具有一定的抑制活性。而且所有受试化合物对病毒转染细胞的细胞毒活性较小，具有进一步研究的价值。