本发明是一种具有HIV整合酶抑制作用的聚乙二醇化拉替拉韦、其药物组合物及其用途，涉及医药技术领域。
背景技术：
拉替拉韦是一种HIV整合酶抑制剂，能快速抑制HIV复制，安全性较高，药物间相互作用少。其适用于与其它抗反转录病毒药物联合使用，用于治疗人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染。
HIV-1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶，也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点。HIV病毒入侵宿主细胞后，首先将两条RNA链(自带的)逆转录为两条互补的DNA链(HIV病毒为RNA病毒)，然后该酶才会发生作用。该酶与DNA连接酶作用类似，可以使病毒DNA与宿主细胞DNA分子之间脱水缩合，从而连接成为一体，为下一步的转录和翻译，即复制病毒自己做好准备。默沙东的拉替拉韦钾片(艾生特)是利用抑制整合酶的功能来达到治疗艾滋病的目的。
尽管拉替拉韦在艾滋病治疗时具有较好的疗效，但是其存在较大的副作用，具体表现为在临床上显示出头痛、腹泻、恶心等不良反应，从细胞层面数据显示，副作用主要体现在药物对细胞的毒性作用较大。
因此，有必要在不降低药物抗HIV治疗效果的情况下，寻找减轻拉替拉韦的毒副作用的药物组合物和应用方法。
技术实现要素：
本发明提供一种具有降低毒副作用的拉替拉韦及其药物组合物，该组合物通过PEG修饰，实现拉替拉韦的PEG化，本发明惊奇地发现，特定聚合度的PEG化的拉替拉韦对细胞的毒性显著下降，且抗病毒活性提高。
本发明的如式I所示的化合物
本发明还提供一种制备式I化合物的方法，包括将含有拉替拉韦钾和五甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯的溶液在碱的存在下加热反应，反应结束后分离纯化得产品。
本发明还提供一种药物组合物，包括上述的PEG化的拉替拉韦与药学上可接受的载体。
本发明药物组合物的优选方案中，药物组合物中还包括助剂。
本发明药物组合物的优选方案中，药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明药物组合物的用途包括利用聚乙二醇化的拉替拉韦作为HIV聚合酶抑制剂，治疗HIV感染引起的疾病。进一步地，本发明药物组合物的用途还包括利用聚乙二醇化的拉替拉韦与其他HIV治疗药物的联合应用，用于治疗HIV感染引起的疾病，其中所述其他HIV病毒感染性疾病治疗药物包括拉米夫定、司他夫定、去羟肌苷、奈韦拉平、依非韦仑或茚地那韦或它们的组合。
尽管现有技术中某些小分子药物经过聚乙二醇化之后显示出较未聚乙二醇化的药物更低的毒性，但是并没有明确的数据或证据能够显示聚乙二醇化修饰的药物一定较未修饰的药物具有更低的毒性作用，更没有现有技术证据显示聚乙二醇化的拉替拉韦能够在不降低拉替拉韦药效的前提下具有更低的毒性作用。
具体实施方式
四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯、五甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯和六甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯购自北京键凯科技有限公司，拉替拉韦钾购自上海江莱生物科技有限公司，其余均购自国药集团化学试剂有限公司
实施例一、mPEG5-拉替拉韦(GQ-80402)的制备
将拉替拉韦钾(14.1g，29.2mmol)、五甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(21.4g，52.6mmol)和K2CO3(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加热升温至100℃保温反应7h。冷却至室温，加入蒸馏水(350mL)，搅拌混合均匀。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品6.9g，收率34.8％，HPLC纯度98.0％。ESI-MS：679[M+H]+。
所获得的产物I为mPEG5-拉替拉韦(GQ-80402)。
对比例1：mPEG4化拉替拉韦的制备-对照A
将拉替拉韦钾(14.1g，29.2mmol)、四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(52.6mmol)和K2CO3(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加热升温至100℃保温反应7h。冷却至室温，加入蒸馏水(350mL)，搅拌混合均匀。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品6.4g，，HPLC纯度98.0％。ESI-MS：635[M+H]+。
对比例2：mPEG6化拉替拉韦的制备-对照B
将拉替拉韦钾(14.1g，29.2mmol)、六甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(52.6mmol)和K2CO3(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加热升温至100℃保温反应7h。冷却至室温，加入蒸馏水(350mL)，搅拌混合均匀。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品6.5g，，HPLC纯度98.0％。ESI-MS：723[M+H]+。
实施例四、化合物GQ-80402在细胞培养内的抗HIV-1活性
4、材料和方法
4.1试验材料
4.1.1药物
待试药物：
化合物GQ-80402，批号：080402，水不溶，DMSO可溶解，试验时用DMSO溶解配成适当浓度后用培养基稀释，立即加入细胞培养。
阳性对照药：
拉替拉韦(RAL)，购自默沙东市售药品，片剂，规格400mg，避光、密闭、干燥处保存。
对照A，对照B按对比例1和2的方法制备。
4.1.2病毒
HIV-1实验病毒株选用HIV-1IIIB，由南开大学惠赠。按常规方法培养制备HIV-1病毒。HIV-1感染性滴定按常规方法进行。病毒小量分装于冻存管，-80℃保存。
4.1.3细胞
人T淋巴细胞系MT-4细胞由南开大学惠赠。细胞培养基：RPMI-1640完全培养基，含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM2-巯基乙醇，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
细胞按常规方法进行复苏，传代：从液氮中复苏细胞，用RPMI-164培养基洗去冻存液，加入含10％FCS的完全培养基10ml，混匀，37℃ 5％CO2培养。每隔3天对细胞传一次代。实验前1天传一次代，使所用细胞处于对数生长期。
4.1.4主要试剂
RPMI-1640、胎牛血清、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、HEPES(N-2，2-Hydroxyothyl piperazine-N′-2-ethanesufonic acid)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑蓝)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)、DMF(N，N’-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)、Triton X-100、青霉素(Penicillin)、谷氨酰胺(Glutamine)、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二甲基亚砜(DMSO)。
4.1.5主要仪器
酶标仪(Biotek ELX800)、离心机(Thermo IEC CL40)、二级生物安全柜(Thermo Forma Class II，A2)、CO2培养箱(Thermo)、加样枪(Thermo Finnpipeette F2)。
4.2试验方法
4.2.1 GQ-80402对MT-4细胞的毒性试验
4×105/ml MT-4细胞悬液100μl与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800 ELISA仪测定OD值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％Cytotoxic concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系MT-4产生毒性时的药物浓度。
4.2.2 GQ-80402对HIV-1IIIB感染MT-4细胞致细胞死亡的保护试验
在96孔板上，将待测药物按照5倍梯度稀释，每孔加50μL 8×105/mL的MT-4细胞与HIV-1IIIB病毒上清(MOI＝0.03)，同时设置仅含MT-4细胞的阴性对照孔、未加化合物但含有MT-4细胞与病毒的阳性对照孔、以及阳性药物对照组。置37℃，5％CO2培养箱内培养，第3天每孔补充100μL培养基，第6天用MTT方法测OD值。计算药物对细胞生长的抑制率和对HIV-1IIIB感染细胞的保护率。CC50为对50％的宿主细胞产生毒性的药物浓度；EC50为保护50％的HIV-1IIIB感染细胞存活时的药物浓度。
4.3结果
4.3.1化合物GQ-80402对MT-4细胞的毒性试验结果
MT-4细胞是HIV-1敏感的T细胞，MT-4感染HIV-1不会形成合胞体但会导致细胞迅速死亡，本实验采用MTT法，检测GQ-80402对未感染的MT-4 细胞的毒性。结果如表1所示。
表1 GQ-80402和RAL对MT-4细胞的毒性作用
从MT-4细胞的毒性试验结果可以看出，GQ-80402的细胞毒性最低，而对照A，B虽然同样对拉替拉韦钾进行了修饰，但是效果不明显。
4.3.2化合物GQ-80402对HIV-1IIIB感染MT-4细胞致细胞死亡的保护试验结果
MT-4细胞在感染HIV后，6-7天会导致细胞死亡，加入药物后如果细胞能存活，则表明化合物有抗HIV作用，并保护细胞不受HIV导致的死亡作用。结果如表2所示。
表2 GQ-80402和RAL对HIV-1IIIB感染MT-4细胞的保护试验
表2续
由表1和表2可知，GQ-80402对MT-4细胞的毒性较小，对HIV-1IIIB感染的MT-4细胞有很好的保护细胞不受HIV导致死亡的作用，同时还增强了对病毒的抑制作用，具有良好的应用开发前景。而其他聚合度PEG化拉替拉韦对MT-4细胞的保护作用以及对病毒的抑制作用与阳性药物相差不大。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。