一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法与流程

文档序号:18545754发布日期:2019-08-27 21:38阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于包括以下步骤:

1)取传染性法氏囊病病毒接种15~30日龄SPF鸡,72~96小时后剖检取出法氏囊组织,研磨,对研磨液进行10-1~10-3倍稀释;

2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒,再重复步骤1)2~4次,得到病毒组织液;

3)取以9~11日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞,以2×106~3.0×106细胞量/mL的接种量接种至含有5~10%(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜;

4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10-2~10-3倍后接种于步骤3)所得产物中,培养48~72小时后收获病毒液;

5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液,再重复步骤4)1~2次,得到CEF驯化种毒;

6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化,驯化过程包括:

A)取步骤5)所述CEF驯化种毒,进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板,于35~40℃吸附1h,弃去病毒液,加入含琼脂糖的病毒维持液,35~40℃条件下倒置培养72~96小时,挑取稀释倍数最大孔的蚀斑,将其溶于不含血清的病毒培养液,即得到蚀斑病毒;

B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒,再重复步骤A)2~4次,收获病毒。

2.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10-1~10-3倍稀释,而后再接种。

3.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养,均是在37℃下进行的。

4.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤4)中接种前,步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。

5.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤6A)所述梯度稀释的稀释倍数分别为:10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍。

6.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤6A)中DF-1细胞是利用以下成分的培养基培养的:含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。

7.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤6A)中所述病毒维持液是含有2%胎牛血清的DMEM/F12培养基。

8.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤6)完成后继续执行以下步骤7):

M)以步骤6)所得产物为种毒,进行10-2~10-3倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞,37℃培养下培养18~30小时,收获病毒液,检测TCID50;

N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒,再重复步骤M)5~9次。

9.根据权利要求8所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法,其特征在于步骤M)所述检测TCID50具体包括以下操作:消化DF-1细胞并计数,以2×105细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板,100μL/孔,37℃培养20~28小时,将待测病毒做10倍系列稀释,弃去细胞液,加入10-6、10-7、10-8稀释度病毒液,37℃条件下培养96小时,按100%细胞病变判定效价。

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