本发明属于干细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种脐带间充质干细胞的无血清培养液及其制备方法和用途。
背景技术：
：人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)来源于脐带华尔氏通胶，可在不同生长因子的调节下分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型。人脐带间充质干细胞具有取材方便，来源广泛，无伦理学限制等优势，不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人脐带间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用。作为目前临床干细胞中应用较广泛的干细胞，人脐带间充质干细胞已开展了多种类型疾病的临床应用研究。传统的人脐带间充质干细胞培养基，添加动物血清以供应细胞生长所需的营养物质，但会给干细胞的生产与科研带来多种不利因素，如：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，以满足干细胞的培养要求，同时避免因使用血清带来的诸多不利因素。血清替代成分较复杂，包括生长因子、蛋白等营养成分。无血清培养基是人脐带间充质干细胞走向临床应用的重要条件，也是近年来的研究热点之一。中国专利申请CN105420182公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠和纤连蛋白等，通过添加较高含量的纤连蛋白实现了较好的贴壁性能，但细胞增殖速率较慢。中国专利申请CN104877963公开了一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白和β细胞素，通过添加纤维连结蛋白和胎球蛋白增强了人脐带间充质干细胞的贴壁性能，通过添加β细胞素维持人脐带间充质干细胞的干细胞特性，组分较复杂，成本较昂贵。目前已有一些市售脐带间充质干细胞无血清培养基，如Gibco、赛业生物科技等公司的脐带间充质干细胞无血清培养基，但存在价格昂贵、贴壁性能不够理想等缺点，贴壁性能不佳会对脐带间充质干细胞的增殖、分化等一系列反应产生影响。因此，提供一种成分较简单、贴壁性能优良的无血清培养基以促进脐带间充质干细胞的增殖具有重要意义。技术实现要素：为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基，通过添加少量的二氢杨梅素和儿茶素，可显著提高脐带间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，利于脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性保持，培养基的成分较简单，成本较低。本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。本发明提供一种脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素。采用上述技术方案，以DMEM低糖培养基为基础，在添加转铁蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子等营养成分的同时添加一定量的二氢杨梅素和儿茶素，儿茶素的浓度不宜过高，可显著提高脐带间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在的贴壁性能不够理想的问题，利于脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性保持，成脂和成骨诱导分化潜能佳，培养基的成分较简单，成本较低。虽然脐带间充质干细胞和脂肪干细胞都属于干细胞，较多培养基成分可以通用，但仍对培养基有各自的要求，培养基成分的浓度也不尽相同。DMEM低糖培养基提供糖类、L-谷氨酰胺和无机盐等基础物质，为脐带间充质干细胞的新陈代谢提供能量来源。转铁蛋白为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁，起到铁传递的作用。血清白蛋白可作为脐带间充质干细胞生长的营养来源，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤。胰岛素可提高脐带间充质干细胞的合成代谢能力，刺激细胞的生长增殖。血小板衍生生长因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)和转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)则主要起到脐带间充质干细胞生存维持和增殖刺激的作用。β-巯基乙醇具有抗氧化的作用，避免蛋白质因氧化而失活。二氢杨梅素(dihydromyricelin，DMY)为葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中主要活性成分黄酮类化合物，分子式为C15H12O8；现有研究表明，DMY具有抗氧化、清除体内自由基、消炎、止咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗高血压、降脂、抗肿瘤、保肝护肝等诸多功效，未见将DMY用于干细胞培养的报道。儿茶素(catechin)是茶汤中最主要的成分，呈苦涩味，通过从茶叶中提取得到，具有防治心血管疾病、控制肥胖、预防癌症等多种功能，可以清除自由基，常用作抗氧化剂，在染料和鞣革工业也得到较广泛的应用。优选地，所述转铁蛋白的浓度为10～50μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为0.5～5mg/mL，所述胰岛素的浓度为10～50μg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述转化生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为1～20μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为10～50μg/mL，所述儿茶素的浓度为1～20μg/mL。优选地，所述转铁蛋白的浓度为20～40μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为1～3mg/mL，所述胰岛素的浓度为15～30μg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述转化生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为5～15μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为15～30μg/mL，所述儿茶素的浓度为5～15μg/mL。上述浓度是发明人经大量试验筛选确定的优选浓度，对脐带间充质干细胞的贴壁、增殖和干细胞特性保持起到重要作用。更优选地，所述转铁蛋白的浓度为25μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为2mg/mL，所述胰岛素的浓度为25μg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为25ng/mL，所述转化生长因子的浓度为25ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为25μg/mL，所述儿茶素的浓度为10μg/mL。优选地，所述胰岛素为重组胰岛素，所述血小板衍生生长因子为PDGF-BB，所述转化生长因子为转化生长因子-β1。优选地，所述的脐带间充质干细胞的无血清培养基还包括青霉素和/或链霉素。更优选地，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL。相应地，本发明还提供脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞的无血清培养基。优选地，所述制备方法还包括加入青霉素和/或链霉素的步骤。此外，本发明还提供了脐带间充质干细胞无血清培养基在脐带间充质干细胞培养中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基，通过添加少量的二氢杨梅素和儿茶素，可显著提高脐带间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在的贴壁性能不够理想的问题，利于脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性保持，成脂和成骨诱导分化潜能佳，培养基的成分较简单，成本较低，实现了二氢杨梅素和儿茶素在脐带间充质干细胞培养方面的应用，也为脐带间充质干细胞的培养提供了新的选择，综合性能优于含胎牛血清的脐带间充质干细胞培养基。本发明提供的脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法简单，可以制得质量稳定的脐带间充质干细胞无血清培养基。附图说明图1脐带间充质干细胞使用不同培养基培养的增殖曲线。图2实施例一组的培养基培养hUCMSCs至第5代的细胞形态图。图3成脂细胞相关基因FABP4的相对表达水平结果图。图4成骨细胞相关基因OPN的相对表达水平结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步详细的描述。本发明中，所涉及的组分、试剂和试剂盒均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得，如DMEM低糖培养基购自Gibco，货号11885-076。实施例一脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，胰岛素的浓度为25μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为25μg/mL，儿茶素的浓度为10μg/mL。本发明中，各组分的浓度均以脐带间充质干细胞无血清培养基的终体积计。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞的无血清培养基。实施例二脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为40μg/mL，血清白蛋白的浓度为1mg/mL，胰岛素的浓度为30μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为30ng/mL，表皮生长因子的浓度为15ng/mL，转化生长因子的浓度为20ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为5μg/mL，二氢杨梅素的浓度为30μg/mL，儿茶素的浓度为15μg/mL。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞的无血清培养基。实施例三脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为20μg/mL，血清白蛋白的浓度为3mg/mL，胰岛素的浓度为20μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为10ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为20μg/mL，二氢杨梅素的浓度为10μg/mL，儿茶素的浓度为5μg/mL。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞的无血清培养基。对比例1脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇和二氢杨梅素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，胰岛素的浓度为25μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为25μg/mL。制备方法同实施例一。对比例1与实施例一的区别在于：不含儿茶素。对比例2脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，胰岛素的浓度为25μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，儿茶素的浓度为10μg/mL。制备方法同实施例一。对比例2与实施例一的区别在于：不含二氢杨梅素。对比例3脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子和β-巯基乙醇；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，胰岛素的浓度为25μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL。制备方法同实施例一。对比例3与实施例一的区别在于：不含二氢杨梅素和儿茶素。对比例4脐带间充质干细胞无血清培养基脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，胰岛素的浓度为25μg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为25μg/mL，儿茶素的浓度为30μg/mL。制备方法同实施例一。对比例4与实施例一的区别在于：儿茶素的浓度由10μg/mL变为30μg/mL。试验例一脐带间充质干细胞的贴壁检测取未经包被的24孔板，设置实施例一组、实施例二组、实施例三组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组和阳性对照组，分别加入实施例一、实施例二、实施例三、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的无血清培养基以及含10％FBS的DMEM低糖培养基，每组3个复孔，每孔接种1×105个第3代hUCMSCs，放置于细胞培养箱中孵育2h，弃去培养基，使用PBS冲洗去除未贴壁细胞，然后进行消化并收集计数，结果如表1所示。表1不同无血清培养基的细胞贴壁检测结果从表1可知，本发明提供的无血清培养基能显著促进hUCMSCs的贴壁，与阳性对照组的细胞贴壁数相当，差异不具有统计学意义；对比例3组(未添加二氢杨梅素和儿茶素)的hUCMSCs贴壁数最少，贴壁性能较差，说明无血清培养基中所含有的胰岛素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子和转化生长因子等无法显著提高hUCMSCs的贴壁性能；对比例2组(未添加二氢杨梅素)的hUCMSCs贴壁性能较差，说明添加儿茶素的添加无法显著提高hUCMSCs的贴壁性能；对比例1组(未添加儿茶素)的hUCMSCs贴壁性能一般，优于对比例2组和对比例3组，但远不如本发明的实施例一至三组(P＜0.01)，说明二氢杨梅素的添加可以显著促进hUCMSCs的贴壁，但效果远不如二氢杨梅素和儿茶素同时添加；而对比例4组(儿茶素的浓度较高)虽然也能显著促进hUCMSCs的贴壁，但效果远不如本发明的实施例一至三组(P＜0.01)。通过对比各试验组，可以发现：对比例2组和对比例3组不利于hUCMSCs的贴壁，难以实现后续的快速增殖；一定含量二氢杨梅素和儿茶素的共同添加起到了协同促进hUCMSCs贴壁的效果，儿茶素的浓度不宜过高。试验例二hUCMSCs的细胞增殖检测将第3代hUCMSCs以5000个/mL的密度接种到6孔板中，每孔接种2mL，设置实施例一组、实施例二组、对比例1组、对比例4组和阳性对照组，分别加入实施例一、实施例二、对比例1、对比例4的无血清培养基以及含10％FBS的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天进行换液，连续培养9天，培养过程中使用显微镜观察细胞形态，且每天分别将培养的细胞用0.25％胰酶消化，进行细胞计数，绘制细胞密度随培养时间的增殖曲线如图1所示。从图1可知，本发明实施例一提供的无血清培养基所培养的细胞增殖速率明显优于对比例1组和对比例4组，且优于阳性对照组。实施例一组的培养基培养hUCMSCs至第5代的细胞形态如图2所示，细胞呈梭形。试验例三hUCMSCs的细胞表型检测使用实施例一的培养基培养hUCMSCs至第10代，弃去培养基，PBS洗涤后用0.25％胰酶消化，离心后制成悬液，加入单克隆抗体，孵育后，洗涤，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD73和CD90等的表达水平，结果如表2所示。从表2可知，使用本发明提供的无血清培养基培养hUCMSCs至第10代的细胞表型中CD73、CD90和CD105等的阳性率均大于96％，且CD34、CD45和HLA-DR等的阳性率均小于1％，说明hUCMSCs的干细胞特性保持良好。表2使用本发明培养基培养的hUCMSCs表型检测结果分子表型表达水平/％CD7399.14±0.57CD9098.36±0.41CD10599.02±0.61CD16696.58±0.52HLA-ABC97.80±0.46CD140.37±0.04CD190.58±0.05CD340.21±0.03CD450.53±0.07HLA-DR0.36±0.04试验例四hUCMSCs的成脂、成骨诱导分化将第10代hUCMSCs以5000个/mL的密度接种到6孔板中，每孔接种2mL，分别用实施例一的无血清培养基、阳性对照组(含10％FBS的DMEM低糖培养基)进行培养，待细胞长至80％汇合度时，弃去培养基，分别加入成脂诱导培养基，培养3周后，收集hUCMSCs并提取RNA，反转录，用采用实时荧光定量PCR仪成脂细胞相关基因FABP4的相对表达水平，结果如图3所示。此外，分别加入成骨诱导培养基，培养4周后，收集hUCMSCs并提取RNA，反转录，用采用实时荧光定量PCR仪成骨细胞相关基因OPN的相对表达水平，结果如图4所示。从图3和图4可知，本发明提供的无血清培养基所培养的hUCMSCs成脂、成骨诱导分化潜能好，略优于含动物血清的培养基。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3