用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因及引物和应用的制作方法

本发明涉及一种用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因及引物和应用。

背景技术：

水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一。水稻受水稻干尖线虫为害(Aphelenchoides besseyi Christie)，造成巨大的经济损失，世界范围内每年减产10～20％，严重情况下减产超过30％。目前，对水稻干尖线虫的防治措施，主要为加强检疫及播种前浸种，但浸种防治效果有限，且影响水稻发芽势。水稻干尖线虫以成虫和幼虫潜伏在谷粒的颖壳和米粒间越冬，当浸种催芽时，种子内线虫开始活动。播种带病种子后，线虫多游离于水和土壤中，大部分逐渐死亡，少部分遇到幼芽、幼苗，从芽鞘、叶鞘缝隙处侵入。由于缺乏呼吸循环系统，线虫体内的氧含量主要取决于外环境及其体型大小。研究发现，在水稻种植过程中，土壤中的氧气含量受多种因素影响。在缺氧条件下，大部分动植物无法存活。但水稻干尖线虫能通过进入缺氧隐生状态，在缺氧条件下存活数天，当环境适宜时，又恢复正常代谢，为防治水稻干尖线虫增加了难度。

ATP(三磷酸腺苷)是细胞内绝大多数生命活动的直接能源物质。在生物有机体中，生物体需要不断得到能量来维持代谢活动。ATP合成酶是线粒体能量守恒中的核心酶，广泛分布于线粒体内膜、叶绿体类囊体、异养菌和光合菌的质膜上，其利用电子流跨膜产生的质子原动力由ADP(二磷酸腺苷)和无机磷酸盐合成ATP，为生物体提供能量，同时行使水解真核细胞和细菌中ATP的双重功能。大量研究表明，生物对逆境的胁迫响应与能量代谢过程密切相关，外界胁迫会导致生物体中ATP的过度消耗，产生大量的活性氧(ROS，reactive oxygen species)，从而对生物造成伤害。ATP合成酶作为一种重要的辅酶和应激响应酶，在生物抗逆反应中起到重要作用。目前，国内外对植物ATP合成酶的研究相对较多，对ATP合成酶基因调控线虫抗缺氧胁迫功能研究较少。基于ATP合成酶的重要性，通过基因沉默技术，研究ATP合成酶基因沉默后，水稻干尖线虫在缺氧条件下的存活情况，探究ATP合成酶基因在生物防治中的潜力，为防治该线虫开辟新道路。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明提供一种用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因及引物和应用。

本发明所采用的技术如下：一种用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因，其序列如序列表SEQ No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种用于构建水稻干尖线虫的ATP合成酶基因的引物组，如下：

上游引物Ab-ATPs-F：如序列表SEQ No.2所示，

下游引物Ab-ATPs-R：如序列表SEQ No.3所示。

2、一种用于构建水稻干尖线虫的ATP合成酶基因dsRNA的引物组，如下：

合成正义链RNA上游引物Ab-ATPs-TTF：如序列表SEQ No.4所示，

合成正义链RNA下游引物Ab-ATPs-iR：如序列表SEQ No.5所示，

合成反义链RNA上游引物Ab-ATPs-iF：如序列表SEQ No.6所示，

合成反义链RNA下游引物Ab-ATPs-T7R：如序列表SEQ No.7所示。

3、一种用于水稻干尖线虫的ATP合成酶基因Q-PCR检测的引物组，如下：

上游引物Ab-ATPs-qF：如序列表SEQ No.8所示，

下游引物Ab-ATPs-qR：如序列表SEQ No.9所示。

4、如上所述的一种水稻干尖线虫的ATP合成酶基因在防治水稻干尖线虫中的应用。

本发明的ATP合成酶基因在水稻干尖线虫受缺氧胁迫后表达上调，表明该基因在水稻干尖线虫抗缺氧胁迫过程中起作用。通过对该基因的研究，探究ATP合成酶基因在生物防治中的潜力，为使用缺氧胁迫防治该线虫建立基础，提供防治新思路，在防治水稻干尖线虫中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中Q-PCR技术检验Ab-ATPs基因沉默效果图；

图2为实施例1中分别对水稻干尖线虫进行Ab-ATPs基因沉默处理与对照处理后，进行缺氧胁迫时水稻干尖线虫存活数对比图。

具体实施方式

本发明提供的用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因来源于水稻干尖线虫，该基因命名为Ab-ATPs，其长度为1,445bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的ATPs结构域。

实施例1：

防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因的获得及其功能验证。

(一)RNA抽提及cDNA合成：

DEPC处理水清洗水稻干尖线虫(雌虫：雄虫：幼虫＝4:2:1)，离心去水后，液氮下研磨。取研磨粉末，应用TRIzol法(Invitrogen，cat.No.15596-026)提取总RNA。DEPC处理水溶解RNA后，应用AMV反转录系统(Promega，cat.No.A3500)，以Oligo(dT)18为引物，合成第一链cDNA。根据试验手册，应用随机引物法合成第二链cDNA。

(二)水稻干尖线虫ATP合成酶基因完整阅读框克隆

根据转录组测序结果合成水稻干尖线虫ATP合成酶基因引物组：

Ab-ATPs-F:5`-TGT GAT GAT GCC GTC GAT TC-3`，

Ab-ATPs-R:5`-CCT TAG CGT TCT TGG CTG TT-3`。

以cDNA为模板进行完整阅读框序列的PCR扩增(TaKaRar-Taq酶50μL反应体系：94℃30s，58℃1min，72℃1min，进行35个循环)，扩增所得产物送生物公司测序，验证后命名为Ab-ATPs。

(三)Ab-ATPs基因沉默

以水稻干尖线虫cDNA为模板，应用引物组：

Ab-ATPs-T7F：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAA GGC AAA TCG GTT GGT G-3`，

Ab-ATPs-iR：5`-ATT TCA GCG ACT CCT TCC TTC-3`

进行PCR扩增生产正义链模板。

应用引物组：

Ab-ATPs-iF：5`-AGA AGG CAA ATC GGT TGG TG-3`，

Ab-ATPs-T7R：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC ATT TCA GCG ACT CCT TCC TTC-3`

进行PCR扩增生产反义链模板。应用RNAi试剂盒合成正义链与反义链RNA，经退火生产dsRNA。蒸馏水稀释dsRNA浓度至3mg/mL，采用dsRNA喂饲法处理线虫12h，以蒸馏水为对照。

处理后一部分线虫用于提取RNA，反转录后应用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCR System试剂盒进行Q-PCR扩增。

应用引物组：

Ab-ATPs-qF：5`-CAG TTG TTG GCA AAG CTG AG-3`，

Ab-ATPs-qR：5`-GGA GTC GGC CAACTT TCT C-3`

进行Q-PCR扩增，使用2步法PCR，第一步：预变性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40个循环。融解曲线测定从55℃到95℃。

应用水稻干尖线虫28s rRNA基因引物组：

Ab-28s-qF：5`-TAC GAT CGG TGT TCG TTG C-3`，

Ab-28s-qR：5`-CTC ACA TCG TCG ACATCC AA-3`

进行Q-PCR扩增作为对照，验证RNAi效果。对Q-PCR扩增采用相对定量法计算次重复试验初始模板量比值，两配对样本t检验p<0.01，差异显著。结果如图1所示，RNAi后Ab-ATPs表达量显著下降。

另一部分线虫用于无氧水浸泡进行缺氧处理1～6天，每个处理随机选取100条线虫测定存活数，重复三次。结果如图2所示，水稻干尖线虫存活数显著下降。说明水稻干尖线虫ATP合成酶基因沉默，对该线虫抗缺氧能力起到显著影响，可用于该线虫病害的防治。

<110> 东北林业大学

<120> 用于防治水稻干尖线虫的ATP合成酶基因及引物和应用

<160> 9

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> Ab-ATPs

<400> 1

gaaggggttt attaacccaa gtttgagaaa ttccaaacat gaagttttct gcaatctttt 60

tcttaacgat catcgcattc acgggattgt tgtacgttca ctgtgatgat gccgtcgatt 120

cggcagctga caaagtgaag gaaggagccg attatactcg ggacaaagtt catgagggtg 180

cgagcaaagt gaatgaaaag gccgaagacg tgaaggatgg agccagtgcg tatctgcaca 240

aaacgttcga caaggacaaa tgcactggtg aagacggttt cttacccgaa tcgtgtcaac 300

aagtggagga aggaattgag aagattcact cgaagatcga cgattcaatt aacggtaatt 360

gcgtgcactt ttgcttatca cacgtctaac tccgctgggt ttcaagatga tggtaccgta 420

aaccattggg ttcaatcggc caaggaaaaa attcgtgccg ccgccaactt tgtgatgggt 480

catgccgaag aggcgaccga acatttgccg aattcggttg atgaagcgaa acagaagtcc 540

aaggatttgg ctgaagatat tagcgaacat gctcgtgagg gatataacaa agcggaagaa 600

cgagcgaagg accgtgccga acaactccgc gaagaaggca aatcggttgg tgaaactatt 660

gccgacaaag tttctggagc tgctgaatcc gtaaaaaatg ttgctgtcgg agccaaagac 720

aaagttgtcg atgctgctgt tggagccaaa gaagcagttg ttggcaaagc tgaggaagtt 780

caagaggccg ccgaagagaa gaaggatcgt ttgaaacgtg attccgagac tgtcaaagac 840

aaattgggac aagctgctga tgatgtttcg caaaaggctg gtgaggcaaa ggacgcagtc 900

aaagagaaag ttggccgact ccgtcgtgat tccgagactg tcaaagacaa attgggacaa 960

gctgctgatg atgtttcgca aaaggctggt gaggcaaagg acgcagtcaa agagaaagtt 1020

ggcaaagtta aacgagatat tggatcggga gccgaaaaag tgaaggaagg agtcgctgaa 1080

attggctcgg gagttgccga caaagcttcg gatgctgcgg ctggtgcacg cgacgccgcc 1140

gtgaacgccg ccgaaacggc caaagagagt gcagcggccg caggtcaagc cgcagctgaa 1200

acagccaaga acgctaagga tggagtacaa aacgctgccg ccaacgtccg cgatgccact 1260

ggagaaaaga tcgaagatgt tggaaaatcg atccaaggaa aagactccta aacatctgtc 1320

aatgttgcca taaacaagct ttattgttct acaattgttt ctctctttaa cttcattgtg 1380

tatgtaattt gtgttttgtc catatgattt tctgtttata aacaatgtac gagattaaaa 1440

aaaaa 1445

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-F

<400> 2

tgtgatgatg ccgtcgattc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-R

<400> 3

ccttagcgtt cttggctgtt 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-TTF

<400> 4

taatacgact cactataggg agaaggcaaa tcggttggtg 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-iR

<400> 5

atttcagcga ctccttcctt c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-iF

<400> 6

agaaggcaaa tcggttggtg 20

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-T7R

<400> 7

taatacgact cactataggg catttcagcg actccttcct tc 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-qF

<400> 8

cagttgttgg caaagctgag 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Ab-ATPs-qR

<400> 9

ggagtcggcc aactttctc 19