本发明涉及一种多糖提取方法，具体涉及新疆一枝蒿多糖提取方法，属于生物医药领域。
背景技术：
多糖(Polysaccharide，PS)是由醛糖或酮糖通过糖苷键聚合而成的大分子，广泛存在于动、植物和微生物中。多糖作为一种重要的生命物质，具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖等多种生物活性。现如今己有不少研究结果表明，糖类作为信息分子在受精、发生、发育分化，神经系统的维持等方面起着重要作用。另外，炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换，细胞识别和病原体感染等生物学过程中也都有糖类的介导。
新疆一枝蒿为菊科蒿属的一种多年生草本植物，味苦，性寒，是维吾尔族传统药材，具有驱风活血、清热解毒、散瘀消肿、健胃消食、抗过敏、抗肿瘤、止吐、止血、解蛇毒等多重功效。临床上用于治疗感冒发烧、肝炎、消化不良、荨麻疹、过敏性疾病等。维吾尔语称之为“一孜乎艾曼尼”。
新疆一枝蒿化学成分主要包括黄酮类、倍半萜类、多糖等物质。徐鑫等(新疆一枝蒿多糖的体外抗氧化性研究，食品科技，2011年第36卷第12期)研究表明，新疆一枝蒿多糖含量高，具有抗氧化、抗衰老活性。因此优化新疆一枝蒿多糖的提取工艺，对于新疆一枝蒿植物资源的综合利用具有重要的意义。
现有的新疆一枝蒿多糖提取工艺有水煮法、微波辅助法，均存在提取率低、工艺复杂、成本高、不适合工业化大生产等缺陷。
技术实现要素：
本发明提供了一种提取率高、工艺简单、成本低、适合工业化大生产的新疆一枝蒿多糖超声波辅助提取工艺。
根据本发明的一个方面，提供一种新疆一枝蒿多糖提取方法，包括以下步骤：
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为75-100％(优选85-98％，最优选95％)的乙醇中，热水浴下回流，晾干。该步骤可以除去脂类、低聚糖、单糖和色素。
(2)取步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，将提取液过滤后浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入浓度为75-100％(优选85-98％，最优选95％)的乙醇，进行醇沉，取沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。此时得到的新疆一枝蒿多糖为粗品。
在优选的技术方案中，本发明的提取方法进一步包括步骤(4)利用动态大孔吸附树脂法进行纯化以脱蛋白，得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
在优选的实施方案中，步骤(1)中，回流2-5次，更优选2-3次，最优选2次；每次0.5-5h，更优选每次1-3h，最优选每次2h；料液比为1:2-1:7(g:mL)，更优选为1:3-1:5(g:mL)，最优选为1:4(g:mL)。
在优选的实施方案中，步骤(2)中，粉碎的新疆一枝蒿过40-60目筛，更优选过40-50目筛，最优选过40目筛；料液比为1:10-1:50(g:mL)，更优选为1:20-1:40(g:mL)，最优选为1:30(g:mL)；提取温度为40-80℃，更优选为60-80℃，最优选为72℃；提取时间为1-5h，更优选为2-3h，最优选为2.5h；超声波功率为200-500W，更优选为300-400W，最优选为350W；在水浴下浓缩，进一步优选水浴温度为70-90℃，更优选75-85℃，最优选为80℃。
在优选的实施方案中，步骤(3)中，浓缩后的提取液和乙醇的体积比为1:3-1:5，更优选为1:4-1:5，最优选为1:4；醇沉时间为4-24h，更优选为8-16h，最优选为12h；醇沉后离心获得沉淀物，更优选3000-4500r/min离心5-15min，最优选4000r/min离心10min。
在优选的实施方案中，步骤(4)中树脂为HPD-300树脂、LS-46D树脂或HP-600树脂；优选，按湿法装柱，加入浓度为1.5-4.0％(优选2.0-3.0％，最优选3.0％)的新疆一枝蒿多糖水溶液，用蒸馏水洗脱，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。在进一步优选的实施方案中，步骤(4)中，新疆一枝蒿多糖溶液的流速为0.5-2.5mL/min，更优选为0.8-2.0mL/min，最优选为1.0mL/min；蒸馏水的流速为0.2-2.0mL/min，更优选为0.3-1.5mL/min，最优选为0.5mL/min。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及根据上述提取方法提取得到的新疆一枝蒿多糖。本发明的新疆一枝蒿多糖可用于制备抗衰老的保健品和药品。
与现有技术相比，本发明的优点是新疆一枝蒿多糖粗品的提取率至少为3.11％，较传统水煮法提取工艺多糖提取率(1.67％)提高1.64％。且本发明成本低，提取条件准确可靠，工艺流程简单，可实现大规模生产。本发明制备得到的新疆一枝蒿多糖粗品在浓度为2.5mg/mL时对羟自由基和DPPH的清除作用均高于60％。本发明纯化多糖粗品的方法，多糖得率至少为77.9％，而利用静态大孔吸附树脂法脱蛋白法纯化多糖粗品的方法，多糖得率仅为51.7％，利用酶法—Sevage法联合脱蛋白法纯化多糖粗品的方法，多糖得率仅为50.5％。
下面通过说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1本发明的新疆一枝蒿多糖粗品清除羟自由基和DPPH的活性
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:4(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:30(g:mL)，提取温度为72℃，提取时间为2.5h，超声波功率为350W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.11％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为79.6％。
其中多糖粗品提取率的计算方法为：
新疆一支蒿多糖粗品提取率(％)＝多糖粗品质量/原料质量×100％
纯化多糖方法的多糖得率的计算方法为：
新疆一支蒿纯化多糖得率(％)＝脱去游离蛋白的多糖质量/多糖粗品质量×100％
实施例2
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:4(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:20(g:mL)，提取温度为70℃，提取时间为2.5h，超声波功率为350W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.43％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为78.5％。
实施例3
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:5(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:10(g:mL)，提取温度为80℃，提取时间为2.5h，超声波功率为350W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为2.5％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.41％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为78.0％。
实施例4
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:3(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2.5h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:30(g:mL)，提取温度为60℃，提取时间为3.0h，超声波功率为350W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为3.5％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.52％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为77.9％。
实施例5
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:4(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:30(g:mL)，提取温度为80℃，提取时间为2.0h，超声波功率为300W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.45％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为78.4％。
实施例6
(1)取新疆一枝蒿，置于浓度为95％的乙醇中，料液比为1:4(g:mL)，热水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)将步骤(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，过40目筛，置于水中，利用超声波辅助提取新疆一枝蒿多糖，料液比为1:30(g:mL)，提取温度为70℃，提取时间为2.5h，超声波功率为400W，将提取液过滤后，80℃水浴浓缩。
(3)取步骤(2)中浓缩后的提取液，加入4倍提取液体积的浓度为95％的乙醇进行醇沉，醇沉时间为12h，4000r/min离心10min，获得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300动态大孔吸附树脂法脱蛋白：湿法装柱，加入浓度为3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速为1.0mL/min)，用蒸馏水洗脱(流速为0.5mL/min)，收集后得脱去游离蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本实施例中，多糖粗品提取率为3.47％，纯化多糖粗品的方法多糖得率为78.8％。
实施例7
1.新疆一枝蒿多糖粗品清除DPPH自由基活性的测定
配制质量浓度分别为0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的新疆一枝蒿多糖粗品溶液，向96孔微量滴定板中各加入50μL不同浓度多糖粗品溶液和50μL 120μmol/L的DPPH溶液，避光反应半小时后，在517nm处测吸光度值为As，每个样品做3个平行试验。计算DPPH自由基清除率公式如下：
清除率(％)＝[1-(As-Ar)/Ao]×100
按照上述方法，以Vc(抗坏血酸)作为阳性对照进行测定。
式中：As为DPPH与多糖粗品溶液反应的吸光度；Ar为DPPH空白(50μL多糖粗品溶液+50μL 95％乙醇)的吸光度；Ao为未加多糖空白溶液(50μLDPPH+50μL 95％乙醇)的吸光度。
测定不同浓度新疆一枝蒿多糖多糖粗品溶液对DPPH的清除作用，以Vc为阳性对照，酶标仪检测，结果见表1。
表1一枝蒿多糖粗品对DPPH的清除率
2.新疆一枝蒿多糖粗品清除羟基自由基活性的测定
用超纯水分别配制浓度为0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的新疆一枝蒿多糖粗品溶液，在96孔板中依次加入15μL的水杨酸(9mmol/L)、15μL的H2O2(8.8mmol/L)、15μL的FeSO4(9mmol/L)，以及不同浓度的多糖粗品溶液75μL，反应30min(37℃)，超纯水为空白对照组，3次平行重复。于510nm条件下，利用酶标仪测定各自的吸光度值A。按照上述方法，以Vc(抗坏血酸)作为对照进行测定。计算羟基自由基清除率公式如下：
清除率(％)＝(Ao-Ai)/Ao×100
式中：Ai为样液反应的吸光度；Ao为空白对照组的吸光度。
在清除羟基自由基体系中加入不同浓度新疆一枝蒿多糖粗品溶液，以Vc为阳性对照，酶标仪检测，结果见表2。
表2一枝蒿多糖粗品对·OH的清除率
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。