一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用，具体涉及将抗除草剂的Bar基因导入海带雌配子体中，并以此为亲本培育雌雄配子体，获得抗除草剂的孢子体细胞，再经过30天的连续低温培养，获得抗除草剂的海带幼小种苗。本发明属于生物技术领域。

背景技术：

海带(L.japonica)属于褐藻门，是多年生的大型藻类，山东省沿海地区的海带养殖面积达20多万亩，年产鲜海带200多万吨，占全国的90％。海带中含有多种药用活性成分，清淤化痰、降血脂，其多种成分具有抗癌抗病毒的药理作用。在人工条件下用充气悬浮培养的海带雌配子体细胞，生长极快，生物量每周可翻一番，一个月的生物量可提高20倍。

抗除草剂的Bar基因(Bialaphos Resistance Gene)来源于吸水链霉菌，编码了一种PAT蛋白，共183个氨基酸。该蛋白能够使草丁膦氨基乙酰化，从而使草丁膦失去对植物的毒性。该蛋白不含有糖基化的氨基酸位点，没有过敏源，不会引起人体的过敏性反应。因此它的使用是非常安全的。使用Bar基因转化获得的转基因植物有玉米、棉花、烟草、小麦、马铃薯、油菜、白杨树等植物。美国、巴西和墨西哥种植的转基因大豆基本上都是利用Bar基因表达的抗除草剂特性，并进行大面积种植，我国每年进口8000万吨以上含有Bar基因的转基因大豆。

抗除草剂海带孢子体细胞培育的方法是以海带雌雄配子体细胞培养形成可用于种苗的幼小孢子体的种苗培育技术，对于加速海带新品种培育、配子体细胞的大规模生产、以及孢子体人工种苗的培育都应用具有重要价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用，本发明以转化抗除草剂基因Bar获得的雌配子体细胞与同型非转化体雄配子体细胞融合形成杂交孢子体细胞，将杂交孢子体细胞连续低温培养，获得抗除草剂的孢子体幼胚，并形成幼小孢子体种苗。

本发明的技术内容主要为：(1)抗除草剂基因Bar在海带雌配子体细胞内的转化；(2)抗除草剂海带雌雄配子体细胞的共培养及抗除草剂孢子体细胞的培育；3)抗除草剂海带幼小种苗的培养。

本发明的具体技术方案如下：

抗除草剂海带孢子体的制备方法，具体步骤如下：

(1)选取生长中的海带雌配子体品系13号(来源于中国科学院海洋研究所藻类生物学实验室)海带雌配子体细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度在5×10⁵-2×10⁶个/mL(用血球计数板计数)，转化时用60mm的无菌培养皿，将雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈；

优选的，选取生长中的海带雌配子体品系13号海带雌配子体细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度在1×10⁶个/mL。

(2)转化载体的来源和质粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取试剂盒提取质粒pBA002-Bar(在载体pBA002中导入长度为552bp的Bar基因的重组质粒)的DNA，用以基因枪轰击后的共培养和目标基因的转化；

在pBA002载体中的Bar基因大小有552bp，编码183个氨基酸，Bar基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2，经过重组后被插入到Nos启动子之后、E9终止子之前的EcoR I和BglII位点上。

(3)基因枪操作技术过程：挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；

(4)共培养与基因转化：向轰击后的品系13号的雌配子体细胞加入步骤(2)中提取的质粒pBA002-Bar的DNA，在11-13℃条件下共培养48小时；然后加入质量浓度为40mg/L的草丁膦，连续培养三周，筛选出转化的雌配子体细胞，即抗除草剂的雌配子体。经过40mg/L草丁膦筛选的雌配子体细胞呈褐色，非转化细胞不抗除草剂呈绿色，并渐渐分离成单细胞而死亡。

优选的，向轰击后的品系13号的雌配子体细胞加入步骤(2)中提取的质粒pBA002-Bar的DNA，在12℃条件下共培养48小时。

(5)抗除草剂海带孢子体的获得：将抗除草剂的雌配子体与同型非转化体雄配子体细胞进行共培养获得交杂孢子体细胞，经过连续11-13℃低温条件培养，精子和配子体的卵细胞自然融合产生的大量抗除草剂的孢子体幼胚；

优选的，将抗除草剂的雌配子体与同型非转化体雄配子体细胞进行共培养获得交杂孢子体细胞，经过连续12℃低温条件培养。

抗除草剂海带孢子体共培养和低温培养的营养液的组成：灭菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为8-12mg/L，灭菌海水中KH₂PO₄的终浓度为0.8-1.1mg/L；抗除草剂的海带孢子体细胞经过15天的细胞分裂和生产发育长成8-10列细胞的孢子体，经过30天后可以形成26-32列幼小种苗，并长有附着器。

优选的，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为10mg/L，灭菌海水中KH₂PO₄的终浓度为1.0mg/L。

本发明中，抗除草剂的海带幼小种苗的培育

(1)将抗除草剂的孢子体幼胚置于培养液中进行培养；培养液的组成为：灭菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为8-12mg/L，NaNO₃与KH₂PO₄的质量比为10:0.8-1.1；培养条件为每两天更换一次培养液，11-12℃低温光照培养箱培养，光照强度为800Lux，培养8-10天，光照培养与暗培养的时间比例为14小时：10小时；

优选的，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为10mg/L；NaNO₃与KH₂PO₄的质量比为10:1。

(2)对抗除草剂的海带幼小种苗进行培养，同时进行PCR检测，实施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度条件下的除草剂筛选，测试转化的幼小种苗对除草剂草丁膦的耐性，建立完整的海带抗除草剂孢子体细胞无性繁殖体系。

本发明中除特殊说明外，“％”均表示质量浓度。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

通过本发明的技术手段，获得了具有抗除草剂的海带孢子体细胞，进一步培养获得了稳定发育的、具有抗除草剂基因的幼小种苗。本发明可以保持海带孢子体细胞无性繁殖的遗传稳定性。

附图说明

图1为抗除草剂、呈褐色的海带雌配子体细胞，以及不抗除草剂、呈绿色死亡的海带雌配子体细胞图；

图2为抗除草剂的海带孢子体细胞(左)；以及表达抗除草剂基因的海带孢子体幼小种苗及其附着器(右)；

图3为经过PCR验证的海带孢子体中的Bar基因；

图4为带有附着体的孢子体细胞图；

图5为抗除草剂的海带幼小种苗图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明具体实施例中使用的海水取自山东省烟台市沿海，而适合海带生长的海水都适用于本发明。

实施例1抗除草剂海带孢子体细胞的制备方法，具体步骤如下：

(1)选取生长中的海带雌配子体品系13号海带雌配子体细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度在1×10⁶个/mL(用血球计数板计数)，转化时用60mm的无菌培养皿，将雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈；

(2)转化载体的来源和质粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取试剂盒提取质粒pBA002-Bar(在载体pBA002中导入长度为552bp的Bar基因的重组质粒)的DNA，用以基因枪轰击后的共培养和目标基因的转化；

在pBA002载体中的Bar基因大小有552bp，编码183个氨基酸，Bar基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2，经过重组后被插入到Nos启动子之后、E9终止子之前的EcoR I和BglII位点上。

(3)基因枪操作技术过程：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；

(4)共培养与基因转化：向轰击后的品系13号的雌配子体细胞加入步骤(2)中提取的质粒pBA002-Bar的DNA，在12℃条件下共培养48个小时；然后加入质量浓度为40mg/L的草丁膦，连续培养三周，筛选出转化的雌配子体细胞，即抗除草剂的雌配子体。经过40mg/L草丁膦筛选的雌配子体细胞呈褐色，非转化细胞不抗除草剂呈绿色，并渐渐分离成单细胞而死亡，如图1所示。

抗除草剂海带孢子体细胞中DNA的提取和Bar基因的PCR验证

①DNA提取：取在40mg/L除草剂条件下的孢子体细胞放入液氮中研磨，加入200μL DNA提取液(1.0MTris-HCL(pH 6.8)1mL，CTAB200mM 2mL，ddH2O 7.m1，适量巯基乙醇)，65℃温浴20分钟，12000rpm离心10min；

取离心管加入两倍体积的预冷的异丙醇，1/10体积的NaAC，加入上清液，置于-70℃冰箱中保存20min，充分沉淀。12000rpm，离心10min，弃上清；沉淀加入预冷的75％的乙醇，重复洗涤两次后离心。吹干后，用TE溶解DNA，加1μL RNase，37℃保温1小时后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

②PCR反应体系：40μLddH2O，5μL10×PCR Buffer，1μL10mM dNTP，1μL模板，1μLPfu，上、下游引物各1μL。引物序列为：

Jpri-Bar F001 ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGA

Jpri-Bar R552 TCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCG

PCR反应程序：95℃预变性10min；然后95℃30S；55℃50S；72℃

80S，进行34个循环；最后72℃延伸10min。4℃保存。

③凝胶电泳：0.8％琼脂糖凝胶电泳点样，TAC缓冲液，90V，40分钟，紫外灯下检测扩增片段的大小为552bp，如图2所示。

(5)抗除草剂海带孢子体细胞的获得：将抗除草剂的雌配子体与同型非转化体雄配子体细胞进行共培养获得交杂孢子体细胞，经过连续12℃低温条件培养，精子和配子体的卵细胞自然融合产生的大量抗除草剂的孢子体幼胚；

抗除草剂海带孢子体共培养和低温培养的营养液的组成：灭菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为10mg/L，灭菌海水中KH₂PO₄的终浓度为1.0mg/L；抗除草剂的海带孢子体细胞经过15天的细胞分裂和生产发育长成8-10列细胞的孢子体，经过30天后可以形成26-32列幼小种苗，并长有附着器，如图3所示。

转化的海带孢子体细胞经过30天的培养后，存活的褐色海带孢子体不断的生长，并形成细胞团。不同浓度除草剂对海带孢子体细胞的筛选效果可以达到90.0％以上，即使是60mg/L的除草剂使用仍有77.8％的孢子体细胞是可以成活的。测试表明，海带孢子体细胞培养两周后在草丁膦10mg/L、20mg/L、40mg/L的浓度下保持褐色，对草丁膦具有一定的耐性，未被草丁膦杀死，但是其中也有个别的孢子体细胞在40mg/L的浓度下变绿，褪色，是未被转化的、不含有Bar基因的孢子体细胞，附着器发育正常。在60mg/L的浓度下，有较多的海带孢子体细胞变为畸形的、多数未产生附着器。抗除草剂草丁膦Bar基因转化的孢子体细胞测试结果如表1所示：

表1抗除草剂草丁膦Bar基因转化的孢子体细胞测试

实施例2抗除草剂的海带幼小种苗的培育

将抗除草剂的孢子体幼胚置于培养液中进行培养；培养液的组成为：灭菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，灭菌海水中NaNO₃的终浓度为10mg/L，NaNO₃与KH₂PO₄的质量比为10:1.；培养条件为每两天更换一次培养液，11-12℃低温光照培养箱培养，光照强度为800Lux，培养8-10天，光照培养与暗培养的时间比例为14小时：10小时。

对筛选出来的抗除草剂的海带幼小种苗进行培养，同时进行PCR检测，实施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度条件下的除草剂筛选，测试转化的幼小种苗对除草剂草丁膦的耐性，建立完整的海带抗除草剂孢子体细胞无性繁殖体系带有附着体的孢子体细胞如图4所示，抗除草剂的海带幼小种苗如图5所示。

〈110〉中国农业大学烟台研究院、青岛农业大学

〈120〉一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用

〈130〉16-1-1217

〈160〉2

〈170〉PatentIn Version 3.5

〈210〉1

〈211〉552 bp

〈212〉DNA

〈213〉Bar基因

〈400〉1

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagatct ga 552

〈210〉2

〈211〉183AA

〈212〉氨基酸

〈213〉Bar基因编码的蛋白

〈400〉2

MET Ser Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala Asp MET Pro Ala 20

Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro 40

Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu 60

Val Ala Glu Val Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg 80

Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg His Gln Arg Thr 100

Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys 120

Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg MET His Glu Ala Leu 140

Gly Tyr Ala Pro Arg Gly MET Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp 150

Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro Val Leu Pro Val 180

Thr Glu Ile * 183