海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒的制作方法

本发明属于副溶血性弧菌检测技术领域，尤其涉及一种海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒。

背景技术：

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种生长在港湾和河口地区的革兰氏阴性嗜盐菌，可通过水生动物的滤食活动富集在生物体内，因此广泛存在于多种海产品中，包括鱼类、甲壳类、双壳贝类等。其中，牡蛎中含量最高。人食用污染该菌的海产品后可引起腹痛、腹泻，严重时还可引起败血症、休克、昏迷而死亡。近年来，由副溶血弧菌引起的食物中毒在全球范围内暴发，特别是在中国沿海地区的食物中毒病例中，副溶血弧菌已成为微生物性食物中毒的首要病原菌，其引发的食源性疾病已成为当前全球面临的公共卫生问题之一。我国是水产品出口大国，副溶血性弧菌则是我国出口头足类水产品的必检项目，因此在饮水、食品检测和食物中毒源调查、传染病源调查等工作中，经常要检测副溶血弧菌。

目前，食品中副溶血弧菌检测方法主要以国家标准及行业标准为依据，这些方法检验周期长，受主观影响较多，不能满足食品卫生快速反应体系的需求。近年来，PCR技术被广泛应用于本领域，常规PCR方法中开管操作易于污染，造成假阳性的缺陷。荧光定量PCR检测技术具有快速、简便、直观、定量准确等优势，在病原菌检测中已得到广泛应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、灵敏并可实时定量的海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒，以便于基层简便、快捷准确地检测海产品中副溶血性弧菌。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，它们具有以下碱基序列：

上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，

下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。

上述PCR快速检测引物在PCR扩增副溶血性弧菌toxR基因方面的应用。

PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM荧光信号)扩增40个循环，反应耗时45min。

海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；

A液为PCR反应液，含SYBR Premix Ex TaqTM(2×)(Takara宝生物工程大连有限责任公司，规格：1ml×5，Code No.：RR820L，内含TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I)12.5μL和上游引物toxR-F

(10μmol/L)和下游引物toxR-R(10μmol/L)各1μL，去离子水8.5μL；

B液为副溶血性弧菌toxR基因的DNA，作为阳性对照；

上述C液为去离子水，作为阴性对照；

上游引物toxR-F和下游引物toxR-R具有以下碱基序列：

上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，

下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。

上述PCR快速检测试剂盒在PCR扩增副溶血性弧菌toxR基因方面的应用。

PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM荧光信号)扩增40个循环，反应耗时45min。

针对现有海产品中副溶血性弧菌检测存在的问题，发明人以副溶血性弧菌toxR基因为研究对象结合实时荧光定量PCR检测技术(Real-time PCR，RT-PCR)，设计了海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，扩增产物130bp。据此，发明人还组装了相应检测试剂盒并建立了相应检测方法。通过特异性试验、敏感度试验、重复性试验证实，本发明的特异性好、灵敏度高、稳定性好、检测耗时短，是快速检测副溶血弧菌的有效方法。本发明的试剂盒在同一样品重复性试验以及同一样品不同批次试验中结果显示，该方法可用于基层大批量海产品中副溶血性弧菌的检测并且所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。

相对于现有技术，本发明的突出优点具体在于：

1)特异性强

本发明的PCR反应试剂盒中的引物是基于副溶血性弧菌toxR的保守序列设计合成的，试验结果表明可以特异性检测出海产品中的副溶血性弧菌，所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。

2)灵敏度高

本发明检测方法旨在为基层检疫工作者提供一种高效灵敏检测海产品中副溶血性弧菌的检测技术，最低检测限约为1.69×10^-1pg/ml，具有很高的灵敏度，是普通PCR的1000倍且检测过程中不受其他相关肠道细菌的影响，充分展示了其特异性高、灵敏性好的特点。

3)稳定性好

同一次试验内的30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，CT值平均读数为20.95，标准差为0.40，变异系数为1.9％。同一样品在不同30次试验中所获得的CT值也基本相同，CT值平均值为22.15，标准差为0.5155，变异系数为2.5％。以上统计结果表明，本实验所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。

4)简便快捷，易操作；

相较于常规检测技术，该荧光PCR检测技术可以通过建立的副溶血性弧菌DNA浓度与Ct值之间的标准曲线，可以计算待测样品中副溶血性弧菌的DNA的浓度，该反应扩增程序用时短，单循环仅需65s全程反应只需45min即可完成；另外相较于通过试剂盒提DNA，该方法中的细菌DNA提取技术是煮沸法，仅需要简单的加热装置，操作简单，用时短，DNA纯度高，30min内就能提取样品DNA，这大大缩减了检测时间和检测费用，适合各种样品的大批量检测。

附图说明

图1是RT-PCR扩增(引物浓度10μmol/L，退火温度60℃)曲线图。

图2是副溶血性弧菌toxR基因的荧光PCR扩增片段电泳图，图中：M是100 lader Marker 1500，1-2分别副溶血性弧菌DNA组、阴性对照组。

图3是标准样品toxR基因实时荧光定量RT-PCR标准曲线，图中：X轴为副溶血性弧菌DNA浓度对数值，Y轴为CT值。

图4是副溶血性弧菌RT-PCR特异性试验扩增曲线图，图中：S型扩增曲线为副溶血性弧菌，其他为非O1霍乱弧菌、大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌。

图5是副溶血性弧菌RT-PCR特异性试验扩增产物电泳图，图中：M是100 lader Marker 1500，1-7分别为大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌；8是副溶血性弧菌；9是非O1霍乱弧菌。

图6是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性试验扩增曲线图，图中：从左到右样品DNA浓度分别为1.69×10⁸pg/mL、1.69×10⁷pg/mL、1.69×10⁶pg/mL、1.69×10⁵pg/mL、1.69×10⁴pg/mL、1.69×10³pg/mL、1.69×10²pg/mL、1.69×10¹pg/mL、/1.69×10⁰pg/mL、/1.69×10^-1pg/mL。

图7是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性试验溶解曲线图。

图8是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性试验扩增产物电泳图，图中：M是Marker 2000，1-10分别为1.69×10⁸pg/mL、1.69×10⁷pg/mL、1.69×10⁶pg/mL、1.69×10⁵pg/mL、1.69×10⁴pg/mL、1.69×10³pg/mL、1.69×10²pg/mL、1.69×10¹pg/mL、/1.69×10⁰pg/mL、/1.69×10^-1pg/mL。

图9是副溶血性弧菌RT-PCR重复性试验扩增曲线图。

图10是副溶血性弧菌RT-PCR重复性试验溶解曲线图。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 菌株

非O1霍乱弧菌、大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，均采购自广东环凯微生物科技有限公司；绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌为广西大学药理实验室提供；副溶血性弧菌标准菌株(ATCC17802)采购自广东环凯微生物科技有限公司；临床分离菌株为广西部分地区的农贸市场或菜市场销售的海产品中分离得到。

1.2 主要仪器和试剂

美国Bio-rad公司CFX96TM Real-Time system仪，美国Bio-rad公司凝胶成像系统，Simplinano超微量紫外分光光度计，Sigma低温微量超速离心机、水浴锅；SYBR PremixEx Taq II，购自TaKaRa，DNA Marker 2000、购自康为世纪生物科技有限公司；细菌培养基购自北京陆桥技术责任有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据副溶血弧菌toxR基因序列，采用DNAStar软件中的Seqman进行同源性分析，确定在副溶血弧菌菌株内保守、其他菌株间特异的片段，引物由大连宝生物工程有限公司合成，扩增片段长度为130bp；

上游引物toxR-F序列：CGCTCGCTGACCAACAAA

下游引物toxR-R序列：CGCCAAACAAACTCGTGAA

toxR扩增序列(130bp)。

1.4 细菌基因组DNA提取

接种单个菌落于含有1ml的营养肉汤的EP管中，37℃培养18-24h，然后12000r离心5min，弃去上清液，加入200μL去离子水用封口膜密封后混匀，于100℃沸水中煮沸10min，最后12000r离心5min，取上清液-20℃保存备用。

1.5 荧光定量PCR反应体系、反应程序的建立及优化

参照TaKaRa公司产品Taq酶(RR820A)说明书，将荧光定量PCR上游引物、下游引物和ddH₂O同时加入反应体系中，于CFX96^TMReal-Time system仪进行荧光定量PCR扩增。对荧光定量PCR反应体系中各组分浓度和反应程序进行优化，特别是对引物浓度进行筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。选用2、4、6、8、10μmol/L的引物终浓度以及不同的退火温度58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、筛选引物的最佳浓度和最佳退火温度。

1.6 副溶血性弧菌标准品的制备及标准曲线的建立

以副溶血弧菌标准菌株ATCC17802的DNA为模板，采用优化的反应条件扩增目的基因，获得片段大小为130bp的PCR产物(图3)。用Simplinano超微量紫外分光光度计测定其浓度，用双蒸水对标准品进行10×倍比稀释，稀释梯度为1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL，采用优化好的体系进行荧光定量PCR反应，建立副溶血性弧菌DNA浓度与CT值对应关系的标准曲线。

1.7 副溶血性弧菌荧光定量PCR的特异性试验

以非O1霍乱弧菌、大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌等9株食物中常见的细菌作为阴性对照菌株，并用高纯水作为无模板空白对照进行荧光定量PCR扩增反应，通过观察扩增曲线验证引物的特异性。

1.8 副溶血性弧菌荧光定量PCR的敏感度试验

为评价该方法对副溶血性弧菌的检测灵敏度，将副溶血弧菌标准菌液在37℃培养18-24小时，提取细菌基因组DNA后测定其浓度为1.69×10⁸pg/mL，OD260nm/OD280nm值为1.805，再按10×倍比稀释成1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL的梯度，对每个梯度菌液各取2μL分别进行实时荧光定量PCR检测和普通PCR检测，比较两者的最低检测值。

1.9 副溶血性弧菌荧光定量PCR的重复性

通过在同一试验内和不同试验间对同一样品检测的Ct值变异系数(标准偏差/重复值的平均数)来初步评估该方法的重复性。

1.10

结果

2.1 荧光定量PCR反应体系、反应程序的建立及优化

结果表明toxR上下游引物浓度均为10μmol/L时，获得的CT值较小而且荧光强度增加值较大，且退火温度为60℃时，扩增效果最好(图1)。因此优化后的反应体系为：SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μL；PCR Forward Primer(10μmol/L)1μL；PCR ReversePrimer(10μmol/L)1μL；DNA模板2.0μL；去离子水8.5μL，体系总体积25μL。优化后的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，扩增40个循环。

2.2 副溶血性弧菌标准品的制备及标准曲线的建立

以标准副溶血性弧菌DNA为模板扩增，扩增片段与预期相符，大小为130bp(图2)。对标准品DNA进行10倍倍比稀释，取1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL 10个梯度浓度为模板，进行实时荧光定量RT-PCR扩增，根据各稀释度与Ct值绘制标准曲线(图3)、扩增曲线(图6)和溶解曲线(图7)。实验结果显示，所制作的标准曲线在1.69×10⁴-1.69×10⁸DNA浓度范围之间有较好的线性关系，相关系数为0.9995，斜率约为-2.978，截距为41.609，得出细菌DNA浓度与Ct值的线性方程为：y＝-2.978x+41.609。

2.3 副溶血性弧菌荧光定量PCR的特异性试验

将上述9株细菌提取DNA进行荧光定量PCR检测。结果如图显示，只有副溶血弧菌产生S型扩增荧光曲线，其他8株非副溶血弧菌菌株均未出现S型荧光扩增曲线(图4)。对反应产物进行凝胶电泳鉴定，结果显示，只有副溶血弧菌在130bp处才有明显的特异性扩增条带(图5)。

2.4 副溶血性弧菌荧光定量PCR的敏感度试验

采用所建立的实时荧光定量PCR方法能检测到副溶血性弧菌标准品DNA的下限浓度为1.69×10^-1pg/ml。采用普通PCR扩增反应能检测到质粒标准品的下限浓度为1.69×10²pg/ml(图8)。相比较之下，本发明建立的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR比普通的PCR敏感度高了1000倍。

2.5 副溶血性弧菌荧光定量PCR的重复性

对同一样品在同一次试验和不同试验间获得的CT值进行统计，同一次试验内的30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合(图9、图10)，CT值平均读数为20.95，标准差为0.40，变异系数为1.9％。同一样品在不同30次试验中所获得的CT值也基本相同，CT值平均值为22.15，标准差为0.5155，变异系数为2.5％。以上统计结果表明，本实验所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。

3.检测试剂盒的组装

根据以上研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

该试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；

A液为PCR反应液，含SYBR Premix Ex TaqTM(2×)(Takara宝生物工程大连有限责任公司，规格：1ml×5，Code No.：RR820L，内含TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I)12.5μL和上游引物toxR-F(10μmol/L)和下游引物toxR-R(10μmol/L)各1μL，去离子水8.5μL；

B液为副溶血性弧菌toxR基因的DNA，作为阳性对照；

C液为去离子水，作为阴性对照。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒

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<170> PatentIn version 3.3

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